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乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則
（2013年第3號）

一、前言

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid, DNA）定量檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）定量檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。如申請人認(rèn)為有必要增加本指導(dǎo)原則不包含的研究內(nèi)容，可自行補(bǔ)充。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進(jìn)行調(diào)整。

二、適用范圍

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，我國屬乙型肝炎感染地方性流行區(qū)。根據(jù)2006年全國乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查，我國的慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，每年因乙型肝炎導(dǎo)致的肝硬化和肝癌死亡約30余萬例，新發(fā)乙型肝炎病例約50萬～100萬例，乙肝防治是當(dāng)前及今后相當(dāng)長時間內(nèi)要面臨的重要任務(wù)。

乙型肝炎是血源傳播性疾病，主要經(jīng)血（如不安全注射等）、母嬰及性接觸傳播。HBV屬嗜肝脫氧核糖核酸（DNA）病毒科（hepadnaviridae），基因組長約3.2 kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。急性HBV感染DNA存在先陽性后消失的發(fā)展過程，慢性HBV感染的自然史一般可分為4個期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動或低（非）復(fù)制期和再活動期，其中免疫耐受期HBV DNA滴度較高（大于20 000 IU/ml），免疫清除期表現(xiàn)為血清HBV DNA滴度大于2000 IU/ml，但一般低于免疫耐受期。非活動或低（非）復(fù)制期滴度較低（小于2000 IU/ml），部分再活動期患者表現(xiàn)為HBV DNA活動性復(fù)制，但并不是所有HBV感染者都經(jīng)歷以上四期。

HBV已發(fā)現(xiàn)有9個基因型（A～I(xiàn)），每個基因型又可分為不同亞型，且存在基因型之間的重組現(xiàn)象。我國已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D基因型，中東部地區(qū)以B、C基因型占優(yōu)勢，其中北方地區(qū)（長江以北）主要為C2亞型;南方大部分地區(qū)流行株為B2、C2、C1亞型，并有少部分D基因型;西部地區(qū)尤其是新疆地區(qū)以D基因型為主，西部藏族居民中以C/D重組基因型為主;A型和B1亞型罕見。

HBV DNA定量檢測試劑是指利用包括實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）或其他的分子生物學(xué)方法在內(nèi)的核酸檢測技術(shù)，以HBV基因序列為檢測靶標(biāo)，對人血清、血漿及其他人體樣本中的HBV DNA進(jìn)行體外定量檢測的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，可作為乙型肝炎輔助診斷的指標(biāo)之一，還可通過對血液中HBV DNA濃度的檢測可用于HBV感染的輔助診斷、治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷。

本指導(dǎo)原則適用于實(shí)時熒光PCR方法的HBV DNA定量檢測試劑，其他類同用途的核酸定量檢測方法可參照本指導(dǎo)原則，但應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性確定其中具體內(nèi)容是否適用，如不適用，應(yīng)另行選擇符合自身方法學(xué)特性的技術(shù)要求或評價方法。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊申報和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。

本指導(dǎo)原則不適用于國家法定血源篩查用HBV DNA檢測試劑。

三、基本要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)及檢出限等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監(jiān)械〔2007〕229號）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監(jiān)械〔2007〕609號）的相關(guān)要求。

（二）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、試驗(yàn)原理、試驗(yàn)方法、檢測結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)。因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）的要求，境外產(chǎn)品的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明參考文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）的要求，下面對HBV DNA定量檢測試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地制定產(chǎn)品說明書。

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

（1）試劑盒用于定量檢測人血清、血漿等樣本中的HBV DNA，適用樣本類型應(yīng)依據(jù)申報產(chǎn)品的分析性能評估和臨床研究情況進(jìn)行確認(rèn)。

（2）待測人群特征介紹：主要為接受抗病毒治療的乙型肝炎患者。

（3）臨床用途：主要通過對乙型肝炎患者血中HBV DNA基線水平和變化情況的監(jiān)測，用于評估抗病毒治療的應(yīng)答和治療效果監(jiān)測。

如有其他用途（如隱匿性感染的輔助診斷）則應(yīng)對產(chǎn)品適應(yīng)癥人群、預(yù)期用途另行說明，并提供與之相應(yīng)的分析性能評估以及臨床驗(yàn)證等資料。本指導(dǎo)原則內(nèi)容僅針對治療監(jiān)測用途進(jìn)行要求。

（4）應(yīng)當(dāng)說明該試劑檢測結(jié)果不得作為患者病情評價的唯一指標(biāo)，必須結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢測對病情進(jìn)行綜合分析。

（5）明確說明該檢測試劑不得用于血源篩查。

2.【主要組成成分】

（1）說明試劑盒所包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，如定量標(biāo)準(zhǔn)品、陰/陽性質(zhì)控品含有人源組分，應(yīng)提供其生物學(xué)來源、活性及其他特性;說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

（2） 試劑盒中不包含但該項(xiàng)檢測必需的組分，說明書中應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、注冊證號（如有）及其他相關(guān)信息。

（3）如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、注冊證號（如有）以及配套儀器等詳細(xì)信息。

3.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標(biāo)明具體的儲存條件及效期。

4.【樣本要求】

（1）樣本收集要求：結(jié)合臨床需要并參照慢性乙型肝炎防治指南（現(xiàn)行版）推薦的采樣要求。

（2）血液樣本應(yīng)當(dāng)說明對采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說明樣本采集、處理及保存方式。

（3）樣本處理、運(yùn)送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預(yù)處理、運(yùn)送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。如有需要應(yīng)對高于檢測范圍的樣本稀釋方法進(jìn)行規(guī)定。

5.【適用機(jī)型】注明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【檢驗(yàn)方法】詳細(xì)說明試驗(yàn)操作的各個步驟，包括：

（1）試劑準(zhǔn)備及配制方法、注意事項(xiàng)。

（2）詳述待測樣本、相關(guān)校準(zhǔn)品及質(zhì)控品核酸提取的條件、步驟及注意事項(xiàng)。

（3）核酸提取/純化方法的詳細(xì)介紹。

（4）擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

（5）PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及相關(guān)注意事項(xiàng)。

（6）儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況對待測基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇。

（7）基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

（8）校準(zhǔn)方法的描述。

（9）實(shí)驗(yàn)的有效性判斷：試劑盒內(nèi)陰/陽性質(zhì)控品、內(nèi)標(biāo)的Ct值要求。

7.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用IU/ml表示，結(jié)合陰、陽性質(zhì)控結(jié)果，對低于檢出限未檢出、低于定量限、檢測范圍內(nèi)及高于檢測范圍的檢測結(jié)果分別進(jìn)行界定。

8.【檢驗(yàn)方法的局限性】

（1）本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

（2）不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存及處理過程均有可能導(dǎo)致錯誤的檢測結(jié)果。

（3）明確該試劑僅限于規(guī)定的樣本類型及適用機(jī)型。

9.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：

（1）對相應(yīng)國家參考品的符合情況。

（2）最低檢出限及定量限：說明試劑不同樣本類型的最低檢出濃度和最低定量濃度，簡單介紹最低檢出限/定量限的確定方法以及對最低檢出限/定量限驗(yàn)證所采用的基因型。

（3）精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價標(biāo)準(zhǔn)、評價結(jié)果。

（4）線性范圍：確定線性范圍的方法、濃度范圍、相關(guān)系數(shù)等信息。

（5）對不同基因型的覆蓋：驗(yàn)證該試劑對HBV不同基因型的檢測效果。

（6）特異性：

①臨床特異性：應(yīng)采用一定數(shù)量的臨床HBV DNA陰性樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

②交叉反應(yīng)：易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體核酸的驗(yàn)證情況，建議以列表的方式表示經(jīng)過交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體名稱、型別、濃度等信息。

③干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等，應(yīng)注明可接受的最高限值。

④藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對檢測結(jié)果的影響，如未進(jìn)行相關(guān)研究也應(yīng)提供相關(guān)警示說明。

（7）對比試驗(yàn)研究：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

10.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

（1）有關(guān)人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)校準(zhǔn)品、質(zhì)控品或其他可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已通過乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）等項(xiàng)目的檢測為陰性，但截至目前，沒有任何一項(xiàng)檢測可以確保絕對安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對待。

（2）臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》配備設(shè)備及操作人員，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。

（三）擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及編制說明

擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合國食藥監(jiān)械〔2007〕229號和國食藥監(jiān)械〔2007〕609號文件的相關(guān)規(guī)定。另外，對于國產(chǎn)試劑，應(yīng)參考《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），將擬申報產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內(nèi)容作為附錄附于標(biāo)準(zhǔn)正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類”項(xiàng)中引出該附錄內(nèi)容。附錄中應(yīng)將待測靶基因區(qū)域，引物/探針來源及驗(yàn)證情況，各種酶的來源、特性以驗(yàn)證情況等信息的重點(diǎn)內(nèi)容予以明確。

HBV DNA定量檢測試劑的注冊檢測應(yīng)符合相應(yīng)國家參考品檢測要求。產(chǎn)品的性能指標(biāo)應(yīng)與說明書內(nèi)容相符。

如果擬申報試劑已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求不得低于上述標(biāo)準(zhǔn)要求。

（四）注冊檢測

根據(jù)國食藥監(jiān)械〔2007〕229號要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)在國家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。對于已經(jīng)有國家參考品的HBV DNA項(xiàng)目，在注冊檢測時應(yīng)采用相應(yīng)的國家參考品進(jìn)行。

（五）主要原材料研究資料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、酶、標(biāo)準(zhǔn)品或企業(yè)參考品等的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等的相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須穩(wěn)定;如主要原材料源于外購，應(yīng)提供的資料包括：供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

1.企業(yè)內(nèi)部參考品的制備、定值過程。建議采用滅活病毒的血清/血漿建立參考品，不宜使用質(zhì)粒。

2.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。

3.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）組分的主要材料（包括引物、探針、內(nèi)標(biāo)、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

（1） 脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的詳細(xì)驗(yàn)證資料。

（2）引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，并對序列準(zhǔn)確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證。如為外購，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

（3） 探針

特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)PAEG或其他適宜方法純化，在5'-端（和/或3'-端）進(jìn)行標(biāo)記，如熒光素報告基團(tuán)或其他發(fā)光標(biāo)記物，在3'-端標(biāo)記熒光素淬滅基團(tuán)，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化,純度應(yīng)達(dá)到高效液相色譜純。如為外購，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜;應(yīng)對探針的核酸序列及標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進(jìn)行核實(shí)，并作HPLC分析。

（4） PCR反應(yīng)所需酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性;尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對酶活性有合理驗(yàn)證;應(yīng)提供有關(guān)保存穩(wěn)定性、活性及功能實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。

4.內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）、校準(zhǔn)品及質(zhì)控品的原料選擇、制備、定值過程及試驗(yàn)資料。內(nèi)標(biāo)設(shè)置應(yīng)合理，質(zhì)控品宜采用混合陰性人血漿或血清作為基質(zhì)。

5.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（Dnase）和核糖核酸酶（Rnase）污染。

（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。

生產(chǎn)工藝研究的資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、校準(zhǔn)方法、質(zhì)控方法、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應(yīng)原理介紹。

3.基因位點(diǎn)選擇、PCR方法學(xué)特性介紹。

4. DNA提取純化方法優(yōu)化，建議包含純化步驟，內(nèi)標(biāo)、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品均應(yīng)全程參與提取純化，不建議采用煮沸法進(jìn)行DNA提取。

5.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量、加樣量及反應(yīng)體積等。樣本量應(yīng)不少于200微升，加樣量和反應(yīng)體積參考相應(yīng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)研究驗(yàn)證后確定。

6.確定PCR各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

7.對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

8.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件的對比分析，如果有差異應(yīng)分別詳述。

另外，對于試劑盒的內(nèi)標(biāo)、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品設(shè)置，建議企業(yè)參考以下要求執(zhí)行：

（1）樣本反應(yīng)管應(yīng)設(shè)置合理的內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）以對管內(nèi)抑制可能造成的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。申請人應(yīng)對內(nèi)標(biāo)的引物、探針和模板的濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線，但又不能對目的基因的檢測造成競爭性抑制而導(dǎo)致假陰性，對內(nèi)標(biāo)的Ct應(yīng)有明確的范圍要求。

（2）HBV DNA定量檢測試劑的質(zhì)控品應(yīng)至少設(shè)置三個量級水平的系列質(zhì)控品:臨界陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。校準(zhǔn)品和質(zhì)控品均應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對整個PCR反應(yīng)過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對各種質(zhì)控品的Ct做出明確的范圍要求。

（七）分析性能評估資料

申請人應(yīng)提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制或成品驗(yàn)證階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，對于每項(xiàng)分析性能的評價都應(yīng)包括具體研究目的、實(shí)驗(yàn)設(shè)計、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、臨床樣本來源等。分析性能評價的實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)的美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會批準(zhǔn)指南（CLSI-EP）文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。對于HBV DNA定量檢測試劑，建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1. HBV DNA提取

病毒DNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，無論申報產(chǎn)品是否含有DNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細(xì)的驗(yàn)證。臨床標(biāo)本中可能含有各式各樣的PCR抑制物，因此，對于DNA提取試劑的選擇，除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。目前常見的DNA分離純化方法和改良方法各有優(yōu)勢和不足，申請人應(yīng)結(jié)合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇DNA分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料（提取效率、與后續(xù)試驗(yàn)的配合等）。

2.最低檢出限與定量限（分析靈敏度）

（1）最低檢出限與定量限的確定

建議使用國際參考品/國家參考品進(jìn)行梯度稀釋并多次檢測，將具有95%以上陽性檢出率的病毒水平作為最低檢出限。建議最低檢出限應(yīng)不高于30IU/ml。

定量限應(yīng)高于或等于檢出限，將多次（至少10次）測量的結(jié)果符合試劑準(zhǔn)確度要求的最低病毒水平作為定量限。

（2）最低檢出限和定量限的驗(yàn)證

申報試劑應(yīng)在最低檢出限或接近最低檢出限的病毒濃度對不同基因型（至少包括B、C、D型）進(jìn)行驗(yàn)證，總測試數(shù)不少于60次。定量限的驗(yàn)證應(yīng)對不同基因型（至少包括B、C、D型）進(jìn)行驗(yàn)證，總測試數(shù)不少于40次。

企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢出限/定量限驗(yàn)證的各個病毒株的來源、型別確認(rèn)及滴度確認(rèn)試驗(yàn)等信息。

3.線性范圍

線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值臨床樣本（由可溯源至國家參考品/國際參考品的方法定量）進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液應(yīng)使用經(jīng)確認(rèn)為陰性的混合人血清或血漿，應(yīng)包含不少于9個濃度（應(yīng)包含接近最低檢測限的臨界值濃度），使用至少3個批次的試劑進(jìn)行試驗(yàn)。通過評價一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及各水平的準(zhǔn)確度確定該產(chǎn)品的線性范圍。

4.準(zhǔn)確度

對測量準(zhǔn)確度的評價依次包括：與國家參考品（和/或國際參考品）的比對研究、回收實(shí)驗(yàn)、方法學(xué)比對等方法，企業(yè)可根據(jù)實(shí)際情況選擇合理方法進(jìn)行研究。

（1）國家/國際參考品驗(yàn)證

此類檢測試劑有相應(yīng)的國家/國際參考品，應(yīng)使用國家/國際參考品對試劑進(jìn)行驗(yàn)證，重點(diǎn)觀察對相應(yīng)參考品檢測結(jié)果的符合情況。

（2）回收試驗(yàn)。用于評估定量檢測方法準(zhǔn)確測定加入純分析物的能力，結(jié)果用回收率表示。通常對樣本進(jìn)行3～5次回收試驗(yàn)，取平均值即平均回收率。

回收試驗(yàn)注意事項(xiàng)：

①加入的標(biāo)準(zhǔn)液體積一般應(yīng)小于樣本體積的10%;

②盡量使加入標(biāo)準(zhǔn)液后樣本中的被測物濃度接近醫(yī)學(xué)決定水平;

③標(biāo)準(zhǔn)物的濃度應(yīng)該足夠高，以得到不同濃度的回收樣本;

④注意基質(zhì)效應(yīng)，盡量采用與臨床待測樣本一致的基質(zhì)

（3）方法學(xué)比對

采用參考方法或國內(nèi)/國際普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類試劑作為對比方法，與擬申報試劑同時檢測一批病人樣品，從測定結(jié)果間的相關(guān)性了解擬申報試劑與參比方法間的一致情況。如顯著相關(guān)，說明兩檢測系統(tǒng)對病人標(biāo)本測定結(jié)果基本相符，對同一份臨床樣本的醫(yī)學(xué)解釋，擬申報試劑與對比方法相比不會產(chǎn)生顯著差異結(jié)果。

在實(shí)施方法學(xué)比對前，應(yīng)分別對擬申報試劑和對比試劑進(jìn)行初步評估，只有在確認(rèn)兩者都分別符合各自相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后方可進(jìn)行比對試驗(yàn)。方法學(xué)比對時應(yīng)注意質(zhì)量控制、樣本類型、濃度分布范圍并對結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。

5.精密度

測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性，具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)的美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會批準(zhǔn)指南（CLSI-EP）或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求：

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除申報試劑（包括提取組分和聚合酶鏈反應(yīng)組分）本身的影響外，還應(yīng)對PCR分析儀、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

（2）合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對室間精密度進(jìn)行評價。

（3）用于精密度評價的質(zhì)控品應(yīng)至少包括四個水平:

①陰性質(zhì)控品：不含乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）的質(zhì)控品，不得檢出陽性（n≥20）。

②臨界陽性質(zhì)控品：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢出限，陽性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。

③弱陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈弱陽性（高于定量限濃度1個數(shù)量級），陽性檢出率為100%且變異系數(shù)（CV）符合標(biāo)準(zhǔn)要求（n≥20）。

④強(qiáng)陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈中度至強(qiáng)陽性，陽性檢出率為100%且CV符合標(biāo)準(zhǔn)要求（n≥20）。

6.HBV不同基因型的覆蓋

應(yīng)對乙肝病毒不同基因型（至少包括B、C、D型）進(jìn)行檢測，重點(diǎn)考察各基因型病毒樣本的分析靈敏度、準(zhǔn)確性及精密度指標(biāo)，每個基因型的病毒樣本稀釋成至少3個濃度水平，對每水平樣本進(jìn)行重復(fù)測定。

7.特異性

（1）交叉反應(yīng)

①用于HBV DNA檢測試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀（推薦種類見表1）。

②建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為10⁶cfu/ml或更高，病毒為10⁵pfu/ml或更高。

③申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。

表1 用于交叉反應(yīng)研究的微生物（推薦）

（2）干擾物質(zhì)

①潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)（見表2）和常用的治療藥物如普通IFNα（2a、2b和1b）和聚乙二醇干擾素α（2a和2b）[PegIFNα（2a和2b）]、拉米夫定（lamivudine）、阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）、恩替卡韋（entecavir）、替比夫定（telbivudine）等。

②使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗(yàn)證，另外，亦建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（最差條件）條件下進(jìn)行評價。對于常見藥物干擾試驗(yàn)，建議參照相應(yīng)藥物藥代動力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進(jìn)行干擾驗(yàn)證。

③建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測。

表2 建議用于干擾研究的物質(zhì)（推薦）

*為必須驗(yàn)證的干擾物質(zhì)。

8.溯源性

應(yīng)提交詳細(xì)的溯源性研究資料。企業(yè)制備的企業(yè)內(nèi)部參考品、二級參考品、用于制備商品化校準(zhǔn)品的儲備液以及不同基因型的陽性樣本均應(yīng)能夠溯源至國家參考品/國際參考品。使用國家參考品/國際參考品為校準(zhǔn)品，應(yīng)用多臺儀器對企業(yè)一級參考品進(jìn)行校準(zhǔn)，以下逐級對企業(yè)二級參考品、校準(zhǔn)儲備液、陽性參考品進(jìn)行校準(zhǔn)。

9.其他需注意問題

對于適用多個機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用機(jī)型】項(xiàng)中所列的所有型號儀器的性能評估資料。如適用于不同樣本類型，應(yīng)提交對不同樣本類型一致性的驗(yàn)證，包括不同抗凝劑、采血管的驗(yàn)證。

（八）參考值（范圍）確定資料

對于此類試劑，正常人群中不應(yīng)檢出HBV DNA，參考值確定資料主要是指Ct的確認(rèn)資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。

（九）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時穩(wěn)定性（有效期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實(shí)時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點(diǎn)（溫度范圍），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進(jìn)行全性能的分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進(jìn)行評價。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項(xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說明。

（十）臨床試驗(yàn)研究

1.研究方法

對于該類試劑已有同類產(chǎn)品上市，按照法規(guī)要求選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進(jìn)行對比試驗(yàn)研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。

建議預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇兩種對比試劑同時進(jìn)行驗(yàn)證，考察其誤差范圍，選擇其中一種作為正式試驗(yàn)的對比試劑，另一種可作為第三方試劑。對比試劑的適用樣本類型及檢測范圍應(yīng)能夠涵蓋考核試劑的樣本及檢測性能要求，以免造成考核試劑部分性能無法驗(yàn)證的情況。

對比試驗(yàn)結(jié)果不一致（檢測值差異較大）的樣本應(yīng)采用公認(rèn)較好的第三方試劑進(jìn)行驗(yàn)證。

2.臨床研究單位的選擇

建議申請人在選擇臨床研究單位時，應(yīng)考慮到各試驗(yàn)單位之間的平行性和一定的地域代表性，臨床研究單位應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實(shí)驗(yàn)中，考核試劑和對比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

3.臨床試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動。整個試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床研究機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的對比試劑應(yīng)一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計學(xué)分析，同時方案中應(yīng)明確寫明對于對比試驗(yàn)研究中測定結(jié)果不符的樣本進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)的第三方試劑或方法。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗(yàn)應(yīng)樣本數(shù)需不少于500例，其中應(yīng)主要選擇乙型肝炎患者樣本（陽性樣本），不少于450例。在病例選擇時應(yīng)考慮到地域性的差別，應(yīng)涵蓋不少于10例D基因型，應(yīng)注重不同藥物治療的乙型肝炎患者。陽性樣本應(yīng)覆蓋試劑線性范圍，均勻分布高、中、低值。建議選擇不少于50例的陰性樣本進(jìn)行比對試驗(yàn)，陰性樣本主要考慮可能存在的交叉反應(yīng)情況，應(yīng)選擇其他類肝炎病毒感染、其他良性或惡性肝臟疾病患者，以從臨床角度考察其特異性。

臨床試驗(yàn)中所涉及的樣本類型應(yīng)為實(shí)際臨床檢測中常用的樣本類型。對于同時能夠檢測血清和血漿樣本的試劑，應(yīng)對至少50例同一乙型肝炎患者分別采集的血清和血漿樣本進(jìn)行比對試驗(yàn)研究，陽性樣本應(yīng)包括強(qiáng)、中、弱陽性及部分陰性樣本。

臨床研究應(yīng)以新鮮樣本為主，如采用庫存樣本應(yīng)另行說明 。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

對臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，對于本類產(chǎn)品對比實(shí)驗(yàn)的等效性研究，常用相關(guān)性、線性回歸對log10滴度結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，考察兩組數(shù)據(jù)之間是否存在相關(guān)性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗(yàn)假設(shè)，即評價考核試劑與對比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)，對檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行符合率分析，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率。

6.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑的檢測結(jié)果有不一致（檢測結(jié)果差異較大）的樣本，應(yīng)采用臨床上公認(rèn)較好的第三種同類試劑進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

7.臨床試驗(yàn)總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）的要求，臨床試驗(yàn)報告應(yīng)該對試驗(yàn)的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。

（1）臨床試驗(yàn)總體設(shè)計及方案描述

①臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

②病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同年齡段人群的預(yù)期選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)。

③樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

④統(tǒng)計學(xué)方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

（2） 具體的臨床試驗(yàn)情況

①申報試劑和對比試劑的名稱、批號、有效期及所用機(jī)型等信息。

②對各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況、不同基因型分布情況進(jìn)行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

③質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、儀器校準(zhǔn)、質(zhì)控品運(yùn)行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。

④具體試驗(yàn)過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本長期保存、結(jié)果不一致樣本的校驗(yàn)等。

（3） 統(tǒng)計學(xué)分析

①數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗(yàn)證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

②兩組數(shù)據(jù)結(jié)果的相關(guān)性、線性回歸的結(jié)果。

③對相關(guān)性及線性方程的顯著性檢驗(yàn)，驗(yàn)證兩種試劑定量結(jié)果的一致性。

④陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。

⑤以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)。

另外考慮到對不同樣本類型的檢測結(jié)果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型分別進(jìn)行統(tǒng)計分析，以對考核試劑的臨床性能進(jìn)行綜合分析。

（4） 討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡要分析試驗(yàn)結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。

四、名詞解釋

精密度（precision）：在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計學(xué)方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

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