附件：丙型肝炎病毒核酸基因分型檢測試劑盒注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2017年第209號）.doc

丙型肝炎病毒核酸基因分型檢測試劑
注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對丙型肝炎病毒核酸基因分型檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是對丙型肝炎病毒核酸基因分型檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。如申請人認為有必要增加本指導(dǎo)原則不包含的研究內(nèi)容，可自行補充。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、范圍

丙型肝炎病毒（HCV）基因分型檢測試劑是指利用包括分子生物學(xué)相關(guān)方法在內(nèi)的核酸檢測技術(shù)，以HCV基因序列為檢測靶標(biāo)，對人血清、血漿等樣本中的HCV不同基因型進行體外定性檢測的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實驗室指標(biāo)，可作為丙型肝炎感染者臨床診療的輔助指標(biāo)之一。

HCV目前至少可分為6個基因型及多個亞型，1b和2a基因型在我國較為常見，其中以1b型為主，其次為2型和3型，4型和5型僅見于輸入型患者，6型相對較少，還有少數(shù)混合型的患者。不同HCV基因型患者，采用的治療方案以及療程不同。所以，我國《丙型肝炎防治指南》中明確指出，對于丙型肝炎病毒核酸陽性的患者，在抗病毒治療前，應(yīng)進行HCV基因分型。

本指導(dǎo)原則適用于基于實時熒光PCR（polymerase chain reaction）方法的HCV基因分型檢測試劑，其他方法學(xué)的定性檢測方法可參照本指導(dǎo)原則，但應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性確定其中具體內(nèi)容是否適用，如不適用，應(yīng)另行選擇符合自身方法學(xué)特性的技術(shù)要求或評價方法。本指導(dǎo)原則適用于進行產(chǎn)品注冊和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜，應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)及不同基因型檢出能力等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若尚無同類產(chǎn)品批準(zhǔn)上市，則應(yīng)詳細對該產(chǎn)品的有效性及安全性進行論述，說明理論依據(jù)。

申報試劑檢測原理如基于5’-UTR區(qū)段設(shè)計且檢測基因型中包括1型與6型或不同亞型，申請人需提供能有效區(qū)分上述不同基因型或不同亞型的研究資料，如：引物探針設(shè)計研究資料及臨床研究中對該部分基因型進行單獨統(tǒng)計分析的資料。

提交的資料應(yīng)符合《辦法》和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）（以下簡稱2014年第44號公告）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料研究資料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定，并提交工藝驗證報告；若主要原材料購自其他供應(yīng)商，應(yīng)提供的資料包括：供應(yīng)商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。主要包括以下內(nèi)容：

1.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。

2.RT-PCR組分的主要材料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實驗研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等驗證資料。

2.2引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。需提供序列準(zhǔn)確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實驗等驗證資料。如為外購，應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。

2.3探針

特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5’-端（和/或3’-端）進行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。純度應(yīng)達到HPLC純，應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。

2.4PCR反應(yīng)所需酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對酶活性有合理驗證；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)提供有關(guān)保存穩(wěn)定性、活性及功能實驗等的驗證資料。

3.企業(yè)內(nèi)部參考品及試劑內(nèi)對照（質(zhì)控品）

企業(yè)內(nèi)部參考品以及質(zhì)控品設(shè)置必須客觀合理，能夠充分評價產(chǎn)品的質(zhì)量。應(yīng)采用金標(biāo)準(zhǔn)或其他方法對企業(yè)內(nèi)部參考品以及質(zhì)控品中物質(zhì)成分進行確認。參考品及質(zhì)控品與被測臨床樣本在整個試驗過程中應(yīng)保持相同的檢測方式。

3.1陽性參考品及陽性質(zhì)控品

陽性參考品應(yīng)包含試劑盒所能檢測的所有基因類型，每個基因型應(yīng)設(shè)置不同濃度水平，應(yīng)能滿足驗證產(chǎn)品性能的需要，至少設(shè)置兩個濃度水平（弱陽性、中或強陽性）；常見基因型陽性參考品設(shè)置建議采用滅活病毒的血清/血漿。其他基因型陽性參考品設(shè)置可采用模擬臨床樣本，如假病毒。對于陽性參考品的獲取方式建議使用金標(biāo)準(zhǔn)的方法或同類方法或者其他能證明的方法進行確認。

陽性質(zhì)控品應(yīng)包含目標(biāo)靶基因，用于監(jiān)控整個檢測過程，包括：核糖核酸提取，基因擴增和檢測。陽性質(zhì)控品作為單獨檢測過程，用于模擬患者樣本，用于與患者樣本進行同時檢測。

3.2陰性參考品及陰性質(zhì)控品

可采用經(jīng)確認無目標(biāo)靶基因的序列樣本。陰性參考品及陰性質(zhì)控品可反映非特異擴增或檢測過程，當(dāng)不存在目標(biāo)序列時不會得到相關(guān)信號。陰性參考品設(shè)置建議采用滅活的血清/血漿。陰性質(zhì)控品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，對假陽性結(jié)果進行質(zhì)量控制。

3.3檢測限參考品

檢測限參考品是評價產(chǎn)品檢測能力的重要工具，對于定性產(chǎn)品來說，其設(shè)計的合理性顯得非常重要。在基因型設(shè)置方面，應(yīng)包括試劑盒所包含的所有基因型。在濃度設(shè)置方面，應(yīng)采用核酸定量的方法對該參考品進行定量檢測，明確被測物的具體量值，設(shè)置濃度應(yīng)接近產(chǎn)品最低檢出限。

3.4精密度參考品

精密度參考品應(yīng)反映產(chǎn)品檢測的重復(fù)性以及重復(fù)檢測的穩(wěn)定性，該部分參考品應(yīng)采用臨床樣本作為精密度參考品，需包括弱陽性、中等強度陽性兩個濃度水平的精密度驗證。如有必要，建議同時設(shè)置陰性參考品對精密度進行驗證。

3.5內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）

與目標(biāo)靶基因平行提取和擴增，用于對檢測管內(nèi)抑制物造成的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制。不建議使用裸露RNA片段。內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）可采用競爭性或非競爭性的引物設(shè)置。

4.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無DNase和RNase污染。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制。

生產(chǎn)工藝研究的資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控方法、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應(yīng)原理介紹。

3.基因位點選擇、RT-PCR方法學(xué)特性介紹。

4.確定最佳RT-PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。

5.確定RT-PCR反應(yīng)各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

6.對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

7.不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。

（四）分析性能評估資料

申請人應(yīng)提交在產(chǎn)品研制階段對試劑盒所有性能的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。如有相應(yīng)的國家參考品，應(yīng)在分析性能評估階段采用國家參考品對產(chǎn)品性能進行驗證。建議著重對以下分析性能進行研究：

1.HCV核酸分離純化

病毒RNA提取主要有以下目的：富集目的基因、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的重要因素之一。申請人應(yīng)對核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細的驗證。

申請人應(yīng)結(jié)合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇優(yōu)化RNA分離/純化試劑，建議包含純化步驟且內(nèi)標(biāo)、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品均應(yīng)全程參與提取純化，并提供詳細的驗證資料。

2.陽性/陰性參考品符合率

所有基因型的陽性參考品均應(yīng)按要求檢出陽性且基因型別一致，考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對各水平陽性參考品設(shè)置相應(yīng)Ct值的限制；陰性參考品應(yīng)按要求檢出為陰性。

3.最低檢測限

建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)明確各基因型的最低檢出限。申報試劑應(yīng)在最低檢出限或接近最低檢出限的病毒核酸濃度對說明書描述的所有基因型進行驗證。需對申報產(chǎn)品所聲稱的所有基因亞型進行驗證。罕見亞型可采用模擬樣本驗證。

4.分析特異性

4.1交叉反應(yīng)

用于HCV RNA分型檢測試劑交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：

4.1.1核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀的其他病原體。

4.1.2申報產(chǎn)品中不同基因型以及HCV其他基因型對被檢測基因型的影響。對于難以獲得的基因型，可采用針對該基因型構(gòu)建的質(zhì)粒或其他基因工程產(chǎn)品進行交叉驗證。

4.1.3建議用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的病原體對HCV核酸陰性樣本進行交叉反應(yīng)的驗證。申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。

4.2干擾物質(zhì)

潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性干擾物質(zhì)和外源性干擾物質(zhì)。

4.2.1內(nèi)源性干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等。

4.2.2外源性干擾物質(zhì)：常用抗凝劑，臨床常用抗病毒藥物如：干擾素、利巴韋林、常見直接抗病毒藥物（DAAs）等對檢測結(jié)果的影響。

4.2.3建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進行檢測。干擾物濃度的分布應(yīng)覆蓋人體生理及病理狀態(tài)下可能出現(xiàn)的物質(zhì)濃度。應(yīng)注明不同干擾物質(zhì)對被檢測物質(zhì)無干擾的最高限值。對于不易收集的干擾物質(zhì)濃度樣本可使用臨床模擬樣本進行調(diào)節(jié)。

5.精密度

精密度的評價方法可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或申請人的研究習(xí)慣進行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實驗方法可以參考相關(guān)國外或國內(nèi)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進行。申請人應(yīng)對每項精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求：

5.1用于精密度評價的樣本濃度水平應(yīng)至少包括弱陽性、中等強度陽性兩個濃度水平。如有必要，建議同時設(shè)置陰性參考品對精密度進行驗證。

5.2合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實驗室進行重復(fù)實驗以對室間精密度進行評價。

6.不同基因型的混合研究

申請人應(yīng)設(shè)置不同混合比例的基因型進行驗證。因理想的不同濃度比例在臨床機構(gòu)中不易收集，申請人可以使用臨床模擬樣本進行驗證。該部分樣本建議用核酸測序等方法明確樣本中包含的所有基因型序列，同時應(yīng)使用核酸定量等方法確定丙型肝炎總病毒濃度和不同基因型濃度。

如申報產(chǎn)品的結(jié)果判讀無法有效區(qū)分不同基因型混合樣本，應(yīng)在產(chǎn)品說明書中進行注明。

（五）陽性判斷值確定資料

陽性判斷值確定資料主要指對核酸檢測的Ct值進行確認，建議申請人對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認。陽性判斷值研究資料樣本來源應(yīng)考慮不同年齡、性別、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認資料。如采用其他方法對陽性判斷值進行確認研究，應(yīng)說明這種方法的合理性。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少3批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的存儲穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進行評價。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】項中進行詳細說明。

（七）臨床評價資料

申請人應(yīng)在符合要求的臨床機構(gòu)，在滿足臨床試驗最低樣本量要求的前提下，根據(jù)產(chǎn)品臨床預(yù)期用途、相關(guān)疾病的流行率和統(tǒng)計學(xué)要求，制定能夠證明其臨床性能的臨床試驗方案，同時最大限度地控制試驗誤差、提高試驗質(zhì)量并對試驗結(jié)果進行科學(xué)合理的分析。

1.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床試驗方案。各臨床試驗機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由該實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報機構(gòu)的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

方案中臨床樣本信息應(yīng)明確以下信息：采集時間要求、標(biāo)本類型、采樣質(zhì)量的要求，該類要求應(yīng)與產(chǎn)品說明書中規(guī)定的要求一致，如產(chǎn)品說明書中未列明，應(yīng)在臨床方案中列明。

試驗方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各研究機構(gòu)選用的對比試劑應(yīng)完全一致，以便進行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。臨床方案中還應(yīng)明確復(fù)核試劑及方法。另外，擬申報產(chǎn)品（以下稱“考核試劑”）適用的樣本類型、可檢測的基因類型不應(yīng)超越對比試劑的相應(yīng)檢測范圍，若超出對比試劑的檢測范圍，則應(yīng)選擇其他合理對比方法對額外的樣本類型和基因類型進行驗證。

2.臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則，必須獲得臨床試驗機構(gòu)倫理委員會的同意。

3.對比方法學(xué)選擇

3.1如選擇已有同類上市產(chǎn)品，其臨床研究可以選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市且質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，應(yīng)充分了解產(chǎn)品方法學(xué)、臨床預(yù)期用途、主要性能指標(biāo)、陽性判斷值、基因型選擇等，以便對試驗結(jié)果進行科學(xué)分析。采用考核試劑與之進行對比試驗研究，充分考慮已上市同類試劑與考核試劑應(yīng)具有相同基因型，且對比試劑檢測結(jié)果可以區(qū)分不同基因型等特性，確?？己嗽噭┡c對比試劑具有明確可比性。

3.2如選擇核酸序列測定（測序）方法作為此類試劑臨床試驗的對比方法，驗證考核試劑檢測結(jié)果與測序結(jié)果之間的一致性情況，臨床研究報告中應(yīng)對選用的測序方法作詳細介紹。

申請人應(yīng)提供以下關(guān)于測序部分的詳細試驗資料，需由臨床試驗機構(gòu)簽章確認。

3.2.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關(guān)信息。

3.2.2測序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇，分子量、純度、功能性實驗等資料。引物設(shè)計應(yīng)能區(qū)分所有基因型但需避開考核試劑擴增的靶核酸區(qū)段。

3.2.3對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與考核試劑的相關(guān)性能進行適當(dāng)比對分析。

3.2.4測序方法應(yīng)建立合理的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，對臨床樣本的檢測結(jié)果進行質(zhì)量控制。

3.2.5提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。

4.臨床試驗對象選擇

4.1基因型方面的考慮

HCV病毒為RNA病毒，其基因具有顯著的多樣性，不同的地區(qū)和民族，HCV流行的基因型不同。因此，在選擇HCV感染者病例時，首先應(yīng)根據(jù)HCV流行的情況，選擇能代表我國不同地區(qū)流行基因型的HCV感染者病例，以對試劑檢測我國流行的HCV病毒的能力進行客觀科學(xué)的評價。

4.2病例選擇及樣本類型

應(yīng)涵蓋考核試劑所聲稱的所有基因型，應(yīng)選擇部分干擾樣本（交叉反應(yīng)樣本），分析干擾組和病例組結(jié)果，以便對申報產(chǎn)品的臨床性能做出科學(xué)的分析。臨床試驗所需樣本總例數(shù)不少于500例，每種常見基因型或亞型陽性病例數(shù)應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)意義，每種罕見基因型或亞型陽性病例數(shù)可酌情減少。臨床樣本應(yīng)來源于丙型肝炎病毒核酸陽性患者。

因HCV病毒核酸4型和5型基因型感染病例多見于輸入性病例，考核試劑中如包含HCV核酸4型和/或5型，也應(yīng)進行適當(dāng)驗證，考慮到此類樣本的不易獲得性，樣本可來源于HCV核酸陽性患者，也可來源于經(jīng)過科學(xué)驗證的血清盤。血清盤檢測結(jié)果的評價，應(yīng)參考國內(nèi)、國際相關(guān)規(guī)定或文獻，并在產(chǎn)品說明書中對血清盤臨床驗證信息進行說明。

在樣本選擇時，應(yīng)注重患者來源的不同地域性，疾病進展不同階段，不同藥物治療方案等。對于干擾組樣本的選擇，應(yīng)考慮到檢測過程中容易產(chǎn)生的干擾，可能造成假陽性/假陰性的情況，以從臨床角度考察其分析特異性。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

臨床試驗方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，明確評價考核試劑與對比試劑一致性的接受標(biāo)準(zhǔn)（如設(shè)置目標(biāo)值或估計精度等）。對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、不同基因型陰性/陽性符合率等。對于本類產(chǎn)品對比試驗一致性研究，常選擇配對四格表的形式總結(jié)兩種試劑定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表χ2檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法檢測結(jié)果有無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，建議在分析中給出各基因型陽性符合率95%置信區(qū)間的結(jié)果。

6.結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果有不一致的樣本，應(yīng)采用臨床上公認較好的第三種同類試劑或參考方法對結(jié)果進行確認，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進行分析。

7.臨床試驗總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求，臨床試驗總結(jié)報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。

（八）產(chǎn)品風(fēng)險分析資料

產(chǎn)品風(fēng)險分析資料應(yīng)符合2014年第44號公告的基本要求，并參照相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進行風(fēng)險分析。風(fēng)險分析中應(yīng)充分考慮到各種可能影響檢測結(jié)果的因素，如某些樣本在進行HCV核酸基因分型檢測時可能存在一定的干擾、實驗過程不規(guī)范、有些核酸含量低導(dǎo)致的檢測結(jié)果不穩(wěn)定等，申請人應(yīng)根據(jù)這些不確定的因素分析產(chǎn)品應(yīng)用可能存在的風(fēng)險。

（九）產(chǎn)品技術(shù)要求

擬定產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》和2014年第44號公告的相關(guān)規(guī)定。申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請人產(chǎn)品研制、前期臨床評價等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的有關(guān)要求編寫。內(nèi)容主要包含產(chǎn)品性能指標(biāo)和檢驗方法。第三類產(chǎn)品技術(shù)要求中還應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求。

附錄中應(yīng)將待測基因型的基因位點、引物/探針設(shè)計及來源、參考品設(shè)置及驗證資料、各種酶的來源及特性驗證等重點內(nèi)容予以明確。

HCV基因分型檢測試劑的產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)主要包括以下性能指標(biāo)：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。陽性參考品主要考察對試劑盒覆蓋范圍內(nèi)不同基因型的檢測符合性，陰性參考品則重點對申報試劑的分析特異性進行驗證。

（十）產(chǎn)品注冊檢驗報告

根據(jù)《辦法》要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)該在具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進行連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢驗。對于已經(jīng)有國家參考品的檢測項目，在注冊檢驗時應(yīng)采用相應(yīng)的國家參考品進行檢驗；對于目前尚無國家參考品的項目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。

（十一）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、實驗方法、檢驗結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導(dǎo)實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求。境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯應(yīng)準(zhǔn)確且符合中文表達習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標(biāo)注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，明確HCV基因分型檢測試劑說明書的重點內(nèi)容，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

1.1試劑盒用于體外定性檢測已明確為丙型肝炎病毒核酸陽性患者的血清、血漿等樣本中的丙型肝炎病毒基因型。輔助醫(yī)療專業(yè)人員了解患者的丙型肝炎病毒基因型以確定適宜的治療方法。

1.2簡要介紹丙型肝炎病毒基因型的特征，包括不同基因型的特征、不同基因型常見亞型、不同基因型在地域及人群中的分布情況、不同基因型感染的臨床特點。

1.3強調(diào)該試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為治療藥物調(diào)整的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實驗室檢測指標(biāo)等因素對患者治療進行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

2.1對試劑盒檢測能夠覆蓋的所有基因型進行詳細描述（靶序列長度及來源區(qū)段、基因型及相關(guān)特征等），對引物及探針設(shè)計、不同樣品反應(yīng)管組合、對照品設(shè)置及熒光信號檢測原理等進行逐項介紹。

2.2核酸提取純化的方法、原理等。

2.3試劑盒技術(shù)原理的詳細介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對其作用機理作適當(dāng)介紹。

3.【主要組成成分】

3.1詳細說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，陰性/陽性對照品（或質(zhì)控品）可能含有生物源性物質(zhì)的組分，應(yīng)說明其生物學(xué)來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2試劑盒中如不包含該項檢測必需的組分，說明書中應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、注冊證號（如有）及其他相關(guān)信息。

3.3如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、注冊證/備案號（如有）以及配套儀器等詳細信息。

4.【適用儀器】

注明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

5.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標(biāo)明具體的儲存條件及有效期。

6.【樣本要求】

6.1樣本收集要求：結(jié)合臨床需要并參照丙型肝炎防治指南（現(xiàn)行版）相關(guān)要求。

6.2血液樣本應(yīng)當(dāng)說明對采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說明樣本采集、處理及保存方式。

6.3樣本處理、運送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預(yù)處理、運送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。

7.【檢驗方法】

詳細說明試驗操作的各個步驟：

7.1試劑準(zhǔn)備及配制方法、注意事項。

7.2詳述待測樣本、質(zhì)控品核酸提取的條件、步驟及注意事項。

7.3核酸提取/純化方法的詳細介紹。

7.4擴增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及相關(guān)注意事項。

7.6儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況對待測基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇。

7.7基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

8.【陽性判斷值】

該類產(chǎn)品用于定性檢測，Cut-off值是檢測試劑有效區(qū)分檢測結(jié)果陽性和陰性的標(biāo)準(zhǔn)，如產(chǎn)品檢測原理為熒光PCR法。Cut-off的描述包括基線的確定方法和循環(huán)閾值（Ct值）的要求。除Ct值要求外，對于接近Cut-off值的弱陽性結(jié)果或者接近Cut-off值的陰性結(jié)果建議結(jié)合擴增結(jié)果的S形曲線對結(jié)果進行判斷。

9.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對照、陰性對照以及反應(yīng)管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果（Ct值），對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進行詳述。如存在檢測灰區(qū)，應(yīng)對灰區(qū)結(jié)果的處理方式一并詳述。建議將不同結(jié)果的典型性圖譜納入說明書中，便于用戶對結(jié)果的讀取。

10.【檢驗方法的局限性】

10.1該產(chǎn)品僅用于丙型肝炎病毒核酸陽性患者的臨床樣本檢測。

10.2該產(chǎn)品僅用于不同基因型的定性檢測，不適用定量檢測。

10.3如丙型肝炎病毒核酸濃度過低，可能導(dǎo)致丙型肝炎病毒核酸基因型無法有效檢出。

10.4該產(chǎn)品僅用于產(chǎn)品說明書預(yù)期用途所包含的已知基因型的檢測，不適用其他基因型的檢測。當(dāng)本試劑盒檢測結(jié)果為陰性時，并不能排除被檢測者帶有丙型肝炎病毒的其他基因型。

10.5如申報產(chǎn)品因產(chǎn)品原理導(dǎo)致無法對丙型肝炎病毒不同基因型混合樣本進行區(qū)別，應(yīng)在產(chǎn)品說明書中進行注釋，幫助醫(yī)療專業(yè)人員對檢測結(jié)果進行客觀認識。

10.6模板RNA質(zhì)量將影響該產(chǎn)品檢測結(jié)果。模板RNA的質(zhì)量可能受樣本來源、采集過程、運輸條件、樣本處理等因素影響，同時也受RNA提取方法、PCR儀類型、操作環(huán)境以及當(dāng)前分子生物學(xué)技術(shù)的局限性等的限制，可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性和假陰性的檢測結(jié)果。使用者須了解檢測過程中可能存在的潛在風(fēng)險。

10.7該產(chǎn)品以丙型肝炎病毒基因上的特定RNA片段為檢測靶標(biāo)，如試劑盒引物與探針結(jié)合區(qū)出現(xiàn)基因突變或基因型變異體等，導(dǎo)致檢測結(jié)果異常，建議復(fù)核檢測。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

詳述以下性能指標(biāo)：

11.1最低檢出限：說明試劑不同樣本類型及不同基因型的最低檢出限，應(yīng)包括產(chǎn)品聲稱的全部基因型/亞型，簡要介紹最低檢出限的確定方法。如不同基因型之間最低檢出限不同，應(yīng)分別列出。

11.2精密度/重復(fù)性：精密度參考品的組分、濃度及評價標(biāo)準(zhǔn)、評價結(jié)果。

11.3特異性

11.3.1交叉反應(yīng)：易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體以及丙型肝炎病毒其他基因型的驗證情況，建議以列表的方式表示經(jīng)過交叉反應(yīng)驗證的病原體名稱、型別、濃度等信息。

11.3.2干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)及常用抗病毒藥物、干擾素等藥物對檢測結(jié)果的影響。如未進行相關(guān)研究也應(yīng)提供相關(guān)警示說明。

11.4對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

11.5不同基因型混合性能研究（如有）：簡要介紹不同基因型混合檢出研究結(jié)論；如未進行該部分研究，應(yīng)在【檢驗方法的局限性】中進行注明。

12.【注意事項】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

12.2臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、參考文獻

1.《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號），2014年7月30日

2.《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》，（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第16號），2014年9月11日

3.《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》，（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第17號），2014年9月11日

4.國家食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告（國家食品藥品監(jiān)管總局公告2014年第44號），2014年9月5日

5.國家食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于發(fā)布乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測試劑注冊技術(shù)審查等4項指導(dǎo)原則的通告（國家食品藥品監(jiān)管總局通告2013年第3號），2013年5月17日

6.國家食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于發(fā)布丙型肝炎病毒核糖核酸測定試劑等4個醫(yī)療器械技術(shù)審查指導(dǎo)原則的通告（國家食品藥品監(jiān)管總局通告2015年第93號），2015年11月26日

7.中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會，中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.丙型肝炎防治指南（2015年更新版）.臨床肝膽病雜志第31卷第12期2015年12月：1961—1979.

8.中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）.臨床肝膽病雜志第33卷第8期2017年8月：1419—1431.

9.WHO.Guidelines for the screening，care and treatment of persons with hepatitis C infection［EB/OL］.2014-04

四、起草單位

國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。