附件：重組人源化膠原蛋白原材料評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則（2023年第16號(hào)）.doc

重組人源化膠原蛋白原材料評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)醫(yī)療器械所用重組人源化膠原蛋白原材料進(jìn)行充分的研究，并整理形成產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)重組人源化膠原蛋白制成的產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料包括所引用主文檔相關(guān)內(nèi)容的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則系對(duì)醫(yī)療器械用重組人源化膠原蛋白原材料的一般要求，適用于人膠原蛋白的所有型別，注冊(cè)申請(qǐng)人需依據(jù)具體醫(yī)療器械產(chǎn)品的特性對(duì)產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料涉及的原材料相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容的適用性。本指導(dǎo)原則不直接涉及重組人源化膠原蛋白原材料制成的醫(yī)療器械終產(chǎn)品的安全性或有效性評(píng)價(jià)，具體產(chǎn)品的評(píng)價(jià)請(qǐng)參考相應(yīng)的產(chǎn)品注冊(cè)審查指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是對(duì)注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料；需在遵循相關(guān)法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。

一、前言

近年來，隨著基因重組、蛋白質(zhì)組學(xué)等基礎(chǔ)理論、技術(shù)手段和臨床醫(yī)療探索研究的不斷發(fā)展，重組膠原蛋白日益成為重要的生物材料，為相關(guān)醫(yī)療器械的研發(fā)提供了新的思路與方法。重組人源化膠原蛋白是由DNA重組技術(shù)制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合。

重組人源化膠原蛋白僅是重組膠原蛋白的一類，材料特性并不能完全決定最終產(chǎn)品的安全性和有效性。本指導(dǎo)原則中的“原材料”是指用于生產(chǎn)制造醫(yī)療器械用的重組人源化膠原蛋白材料。除特別說明外，本指導(dǎo)原則中的“材料”等同于“原材料”。

重組人源化膠原蛋白是通過基因工程生產(chǎn)的蛋白，工程細(xì)胞構(gòu)建過程、生產(chǎn)用細(xì)胞的質(zhì)量控制及常規(guī)生產(chǎn)過程控制是該原材料生產(chǎn)工藝及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)，此方面主要的驗(yàn)證資料，可參考本指導(dǎo)原則的資料性附件作為原材料研究資料的補(bǔ)充，但不作為產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料的必要內(nèi)容。結(jié)合重組人源化膠原蛋白的特點(diǎn)，該資料性附件修改引用了國家藥監(jiān)局藥審中心《重組制品生產(chǎn)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)量控制技術(shù)評(píng)價(jià)一般原則》《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》等生物制品指導(dǎo)原則的相關(guān)內(nèi)容。

二、評(píng)價(jià)要點(diǎn)

（一）   重組人源化膠原蛋白原材料性能研究

為了確保重組人源化膠原蛋白原材料質(zhì)量可控，重組人源化膠原蛋白需參考相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行必要的鑒別、純度和雜質(zhì)等分析，可采用不同的分析方法對(duì)原材料的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸序列、各種翻譯后修飾（如脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾、脯氨酸羥基化等）進(jìn)行充分鑒定，并進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)，以確認(rèn)終產(chǎn)物具有擬宣稱的原材料構(gòu)象、聚集狀態(tài)、降解狀態(tài)及膠原蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)。

材料理化特性分析需按照醫(yī)療器械制備工藝和特點(diǎn)，結(jié)合其風(fēng)險(xiǎn)控制要求進(jìn)行相關(guān)研究，建議對(duì)如下常規(guī)理化項(xiàng)目進(jìn)行研究，例如氨基酸序列、蛋白空間結(jié)構(gòu)、劑型（如溶液、凍干粉、凝膠、纖維、海綿等）、膠原蛋白型別等特異性性能，同時(shí)結(jié)合醫(yī)療器械特點(diǎn)，完善理化性能指標(biāo)要求。

需根據(jù)不同的預(yù)期用途及使用部位、不同生產(chǎn)工藝、預(yù)期使用效果和最終醫(yī)療器械的狀態(tài)，選擇適用的指標(biāo)；根據(jù)膠原蛋白原材料是否經(jīng)過交聯(lián)或化學(xué)修飾，宜提供交聯(lián)劑或修飾劑的殘留量、降解性能等的研究，提供相應(yīng)的研究報(bào)告。

性能指標(biāo)的建立及驗(yàn)證取決于膠原蛋白原材料性質(zhì)和用途、生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn)工藝的經(jīng)驗(yàn)等多種因素。新的分析技術(shù)及對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)正在不斷進(jìn)行，適當(dāng)時(shí)需使用這些新的技術(shù)。因現(xiàn)有技術(shù)原因而產(chǎn)生偏差的需進(jìn)行合理性解釋說明。

1.鑒別

1.1氨基酸序列及覆蓋度

首先需明確氨基酸序列的選擇依據(jù)，如為特定氨基酸序列片段組成的，還需明確片段重復(fù)次數(shù)及依據(jù)。需采用綜合的方法測(cè)定目標(biāo)膠原蛋白原材料的氨基酸序列，并與其基因序列對(duì)應(yīng)的理論氨基酸序列進(jìn)行比較驗(yàn)證。肽段覆蓋率的檢測(cè)結(jié)果需為100%覆蓋，末端氨基酸序列檢測(cè)結(jié)果需與理論序列完全一致。可按照《重組人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，直接使用供試品檢測(cè)，并選擇適宜的酶解條件進(jìn)行水解，酶解后選擇不小于5個(gè)連續(xù)氨基酸的片段為基本的序列單元進(jìn)行覆蓋分析。

如適用，目標(biāo)膠原蛋白材料的理論氨基酸序列需包括二硫鍵連接方式。氨基酸序列測(cè)定還需考慮可能存在的N端甲硫氨酸（如大腸桿菌來源的膠原蛋白原材料），信號(hào)肽或前導(dǎo)序列。

1.1.1氨基酸組成

使用各種水解法和分析手段測(cè)定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸組成或天然異構(gòu)體比較。如需要時(shí)需考慮分子量的大小。多數(shù)情況下，氨基酸組成分析對(duì)肽段和小蛋白可提供有價(jià)值的結(jié)構(gòu)資料，但對(duì)大蛋白一般意義較小。在多數(shù)情況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。

1.1.2氨基酸末端序列

氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質(zhì)和同質(zhì)性。用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法測(cè)定N端和/或C端氨基酸序列，其結(jié)果需符合理論預(yù)測(cè)。

若發(fā)現(xiàn)目的膠原蛋白材料的末端氨基酸發(fā)生改變時(shí)，需使用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應(yīng)變異數(shù)量。需將這些氨基酸末端序列與來自目的膠原蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列進(jìn)行比較。

1.2肽圖

按照《中華人民共和國藥典》 四部 通則 肽圖檢查法 第一法 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，建立膠原蛋白原材料標(biāo)準(zhǔn)肽圖。

推薦利用四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF MS）建立標(biāo)準(zhǔn)肽圖，作為膠原蛋白材料的指紋圖譜，用于材料的批間一致性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，以及材料特異性的鑒別。

需用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的材料片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠?。盡量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)，N-末端測(cè)序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。至少對(duì)材料成品放行來說,經(jīng)驗(yàn)證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的材料結(jié)構(gòu)/鑒別的適當(dāng)方法。具體分析方法可參考《重組膠原蛋白肽圖指紋圖譜分析》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3分子量

對(duì)申報(bào)醫(yī)療器械所用膠原蛋白材料可參照《中華人民共和國藥典》高效液相色譜法、“電泳法”的“第五法  SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法”、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜方法建立分子量及分布檢測(cè)方法，也可以運(yùn)用其他適當(dāng)技術(shù)測(cè)定分子量，如分子排阻色譜法等。需通過至少一種合理的、經(jīng)驗(yàn)證的方法證明其實(shí)際分子量與理論預(yù)測(cè)一致。

高效液相色譜法目標(biāo)蛋白的出峰保留時(shí)間需與參比品一致；高分辨質(zhì)譜法分子量需與參比品一致；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分子量電泳條帶位置需與參比品一致。同時(shí)，需就參比品的選擇提供合理性依據(jù)。

1.4等電點(diǎn)

按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 電泳法第六法（等電聚焦電泳法）或0542毛細(xì)管電泳法進(jìn)行檢測(cè)，等電點(diǎn)需在標(biāo)示范圍內(nèi)，也可以運(yùn)用其他適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定。

1.5巰基和二硫鍵

如果目的膠原蛋白材料的基因序列存在半胱氨酸殘基時(shí)，需盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜測(cè)定法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

1.6消光系數(shù)（或克分子吸光度）

多數(shù)情況下，可取目的膠原蛋白材料于UV/可見光波長處測(cè)定消光系數(shù)（或克分子吸光度）。消光系數(shù)的測(cè)定為使用UV/可見光或分光光度計(jì)檢測(cè)已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)或定氮法等方法測(cè)定。

1.7電泳圖型

應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SDS－PAGE電泳、免疫印跡、毛細(xì)管電泳法或其他適當(dāng)?shù)姆椒?獲得目的膠原蛋白材料的一致性，同一性和純度的電泳圖譜和數(shù)據(jù)。

1.8液相色譜圖譜

應(yīng)用分子篩色譜、反相液相色譜、離子交換液相色譜、親和色譜或其他適當(dāng)方法，獲得目的膠原蛋白材料的一致性、同一性和純度的色譜圖譜和數(shù)據(jù)。

2.結(jié)構(gòu)表征

2.1脯氨酸羥基化

若在設(shè)計(jì)時(shí)進(jìn)行脯氨酸羥基化，需按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的要求進(jìn)行分析，并規(guī)定標(biāo)示值。

2.2高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

鑒于高級(jí)結(jié)構(gòu)與重組人源化膠原蛋白表現(xiàn)出的性能和功能密切相關(guān)，若材料擬宣稱具有相應(yīng)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，采用多種方法對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析，包括以下列舉的方法及其他結(jié)構(gòu)表征方法，如冷凍電鏡、蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)等方法。

2.2.1三螺旋結(jié)構(gòu)分析

可采用圓二色譜在特定常規(guī)試驗(yàn)條件下的檢測(cè)重組人源化膠原蛋白的CD光譜特征。若采用特定的非常規(guī)條件檢測(cè)，則檢測(cè)結(jié)果僅反映膠原蛋白材料在該條件下可（否）具有形成類似膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的CD光譜特征能力；此時(shí)需分析并闡述所檢測(cè)樣品是否代表“原材料樣品”，還是“原材料樣品”的特定處理（后續(xù)加工）樣品。同時(shí)建議進(jìn)行最低檢出限分析，其結(jié)果需與生理性膠原蛋白相近（相差不超過一個(gè)數(shù)量級(jí)）。可采用X射線晶體學(xué)技術(shù)或冷凍電鏡技術(shù)在原子結(jié)構(gòu)水平考證膠原蛋白材料或其包含的特定氨基酸序列的三螺旋結(jié)構(gòu)特性，計(jì)算有結(jié)構(gòu)信息的序列占整個(gè)蛋白序列的百分比；可采用差示掃描量熱法檢測(cè)膠原蛋白材料結(jié)構(gòu)變化的熱效應(yīng)輔助說明膠原蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)特征；可采用紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，其非特征區(qū)（如：酰胺a、b）和特征區(qū)（如：酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置需與參比品一致；可采用拉曼光譜，其拉曼光譜圖需與參比品一致；也可應(yīng)用其它紫外或可見光吸收光譜法、核磁共振（NMR）等適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)。

2.2.2纖維質(zhì)量/多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表征

若材料預(yù)期形成纖維/網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時(shí)，宜使用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）或原子力顯微鏡（AFM）等方法觀察膠原蛋白材料形成膠原纖維束/多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等，需明確兩種方法具體的制樣和觀察測(cè)定過程。與此相關(guān)的膠原分子自組裝和聚合能力分析，可參考相關(guān)國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。

3.純度

關(guān)于純度的要求可根據(jù)醫(yī)療器械終產(chǎn)品的用途和用法而確定。存在二硫鍵時(shí)重組人源化膠原蛋白可能會(huì)形成寡聚體，且其電泳分子量大小需成倍增加，寡聚體需視為重組人源化膠原蛋白而非雜質(zhì)。

4.含量

需建立重組人源化膠原蛋白含量檢測(cè)方法，含量以質(zhì)量/重量或質(zhì)量/體積表示。含量檢測(cè)可通過液相色譜法（HPLC）、凱氏定氮法、特征多肽法等。

5.雜質(zhì)、污染物和添加劑

對(duì)膠原蛋白材料工藝相關(guān)雜質(zhì)以及外源污染物等進(jìn)行研究，如：細(xì)胞基質(zhì)來源、細(xì)胞培養(yǎng)來源和下游工藝。需對(duì)潛在的工藝相關(guān)雜質(zhì)（如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞DNA、細(xì)胞培養(yǎng)殘留物、下游工藝的殘留物等）進(jìn)行鑒別、評(píng)估，并進(jìn)行定性和/或定量分析，并采用適宜的方法評(píng)價(jià)其對(duì)生物學(xué)功能的影響。工藝相關(guān)雜質(zhì)來源于生產(chǎn)工藝，可分三大類：來源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝。細(xì)菌內(nèi)毒素、微生物限度和無菌性，是常規(guī)的污染物控制要求。

5.1源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)

來源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)包括源于宿主生物體的蛋白/多肽；核酸（宿主細(xì)胞/載體/總DNA）；多糖及病毒。對(duì)于宿主細(xì)胞蛋白，一般需用能檢測(cè)出較寬范圍蛋白雜質(zhì)的靈敏的免疫檢測(cè)方法。需用不含目的基因的生物體粗提物，即不含膠原蛋白編碼基因的生產(chǎn)用細(xì)胞，制備上述試驗(yàn)使用的多克隆抗體?？赏ㄟ^對(duì)膠原蛋白材料的直接分析方法（如雜交技術(shù)法）檢測(cè)宿主細(xì)胞的DNA水平，和/或通過標(biāo)記試驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)室規(guī)模）檢測(cè)證實(shí)通過純化工藝能去除核酸。對(duì)于有意導(dǎo)入的病毒，需驗(yàn)證生產(chǎn)工藝中去除/滅活病毒的能力。

5.1.1外源性DNA殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“外源性DNA殘留量測(cè)定法”的“熒光染色法”或“定量PCR法”進(jìn)行測(cè)定，“熒光染色法”的樣品加標(biāo)回收率需滿足70%～130%；“定量PCR法”的樣品加標(biāo)回收率需滿足50%～150%，需規(guī)定殘留限量。如果樣品中外源性DNA殘留量低于“熒光染色法”的檢測(cè)限，則需采用“定量PCR法”進(jìn)行測(cè)定。

需根據(jù)醫(yī)療器械產(chǎn)品的預(yù)期臨床用途、使用量等，確定含重組人源化膠原蛋白的材料臨床最大使用量的外源性DNA殘留量限值。推薦參考生物制品外源性DNA殘留限量要求，結(jié)合殘留DNA宿主類型及其風(fēng)險(xiǎn)程度設(shè)定每人每次最大使用量限值。

建議參考生物制品中大腸桿菌或酵母菌表達(dá)的基因工程重組生物制品的外源性DNA殘留量限度。

5.1.2宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量

5.1.2.1大腸桿菌蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法”或采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

5.1.2.2酵母蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“酵母工程菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法”或采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

5.1.2.3CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量

采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

5.1.3促炎性污染物（肽聚糖）

采用經(jīng)驗(yàn)證的方法或經(jīng)驗(yàn)證的市售細(xì)菌肽聚糖檢測(cè)試劑盒（ELISA）檢測(cè)殘留肽聚糖，需根據(jù)其致熱反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)規(guī)定可接受的限量要求。

5.1.4碳水化合物結(jié)構(gòu)

根據(jù)細(xì)胞基質(zhì)等因素，必要時(shí)需考慮測(cè)定糖蛋白中碳水化合物的含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外，盡可能分析碳水化合物的結(jié)構(gòu)、寡糖形態(tài)（長鏈狀）和多肽的糖基化位點(diǎn)。

5.2源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)

來源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)包括誘導(dǎo)劑（多核苷酸，病毒）、抗生素、血清及其他培養(yǎng)基組分。需根據(jù)工藝中采用的表達(dá)體系和使用的抗生素類型，采用經(jīng)驗(yàn)證的方法測(cè)定殘余抗生素含量/活性，殘余抗生素含量需符合《重組人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，不應(yīng)有殘余抗生素活性。

殘余抗生素含量的測(cè)定按照YY/T 1849《重組膠原蛋白》中描述的方法或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行檢測(cè)，殘余抗生素活性按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 生物活性測(cè)定法中抗生素微生物檢定法或《中華人民共和國藥典》 四部通則 抗生素殘留量檢查法進(jìn)行檢測(cè)。

5.3源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)

來源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)一般包括酶、化學(xué)/生化處理試劑（如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑）、無機(jī)鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載體/配體（如單克隆抗體），及其他可濾過的物質(zhì)。需結(jié)合實(shí)際情況制定相關(guān)理化指標(biāo)。

5.3.1添加劑

如果使用了防腐劑、凍干保護(hù)劑等添加劑，需給出其限量要求和檢測(cè)方法。

5.3.2重金屬及微量元素含量需符合以下規(guī)定。

5.3.2.1重金屬元素

對(duì)工藝中添加的重金屬元素，需符合規(guī)定限值。

5.3.2.2重金屬含量

重金屬總量（以Pb計(jì)）需符合YY/T 1888《重組人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的限值。

5.3.2.3微量元素含量

微量元素含量：砷（As）、汞（Hg）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、鎘（Cd）、銅（Cu）、鉬（Mo）、鐵（Fe）、鎳（Ni）需符合YY/T 1888《重組人源化膠原蛋白》等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的要求。

5.4細(xì)菌內(nèi)毒素

細(xì)菌內(nèi)毒素相關(guān)限量要求需考慮醫(yī)療器械終產(chǎn)品與人體的接觸方式。

5.5微生物限度

若重組人源化膠原蛋白材料以微生物限度控制狀態(tài)提供，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法和非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果需符合相關(guān)要求。

5.6無菌

若重組人源化膠原蛋白材料以無菌狀態(tài)提供，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 無菌檢查法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果需無菌。

5.7分子變異體

需對(duì)重組人源化膠原蛋白材料的各種分子變異體進(jìn)行分離、鑒別和分析。如變異體的功能與目標(biāo)產(chǎn)物一致時(shí)可不做雜質(zhì)考慮。需考慮在生產(chǎn)和/或貯存期間膠原蛋白材料降解產(chǎn)物是否顯著增加及其與免疫原性的相關(guān)性。以下為最常見的目的膠原蛋白材料的分子變異體，并列出了相應(yīng)的檢測(cè)方法。

5.7.1化學(xué)修飾類型

各種非預(yù)期的翻譯后修飾是導(dǎo)致重組蛋白異質(zhì)性的重要質(zhì)量問題，如：脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾等和其他可能的N端、C端修飾（如乙?；?、酰胺化或者由于外肽酶導(dǎo)致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等），以及各種其他異質(zhì)性（如異構(gòu)化、碎片化、二硫鍵錯(cuò)配、N-連接和O-連接的寡糖、聚集等）。適用時(shí)，需按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的要求，參照《重組膠原蛋白肽圖指紋圖譜分析》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。需考慮脫酰胺、異構(gòu)化、錯(cuò)配二硫鍵連接和氧化形式的分離和鑒別。對(duì)這些變異體的分離和鑒別，可采用層析法、電泳法（如毛細(xì)管電泳）、質(zhì)譜法和/或光譜法（如圓二色譜）。需注意在修飾不會(huì)引起或只引起較小的分子量變化及結(jié)構(gòu)變化的情況下，這些方法可能無法鑒別。此時(shí)，需要結(jié)合功能性試驗(yàn)，評(píng)價(jià)所發(fā)生的修飾是否影響預(yù)期的功能和使用。

5.7.2降解物和聚合體

降解物和聚合體：聚合體包括二聚體和多聚體，可用分子篩層析法（如SE-HPLC）進(jìn)行定量；需建立成品中非預(yù)期降解物的判定標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)穩(wěn)定性試驗(yàn)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

6.熱穩(wěn)定性

如果重組人源化膠原蛋白是多聚體，可采用差示掃描量熱分析（DSC）進(jìn)行解聚溫度分析?？蓞⒖肌吨腥A人民共和國藥典》 四部。

如果是單鏈的蛋白肽，可參考《中華人民共和國藥典》 四部，人免疫球蛋白3.3.2.4熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，將供試品置（57±0.5）℃水浴中保溫4h后，用可見異物檢查裝置，肉眼觀察需無凝膠化或絮狀物。

7.其它理化指標(biāo)

膠原蛋白材料其它性能指標(biāo)宜根據(jù)醫(yī)療器械終產(chǎn)品特性及相關(guān)通用要求制定，在適用時(shí)，需對(duì)相關(guān)性能指標(biāo)檢測(cè)方法使用的參比品進(jìn)行性能研究，對(duì)照品技術(shù)參數(shù)需明確且性能穩(wěn)定。用于理化測(cè)定等方面的參比品，需進(jìn)行必要的分析鑒定，包括但不限于：

7.1外觀（如性狀、顏色）

用肉眼直接觀測(cè)，需為白色/淡黃色/無色透明液體或凝膠，或白色/類白色凍干粉或海綿狀固體。

注：隨著行業(yè)發(fā)展，可能存在其他外觀要求，需根據(jù)原材料具體形態(tài)規(guī)定外觀要求。

7.2可見異物

按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 可見異物檢查法第一法（燈檢法）進(jìn)行檢測(cè)，需無明顯異物。

7.3溶解性

需根據(jù)供試品的溶解特性，對(duì)供試品在水、稀酸或中性鹽溶液中的溶解程度進(jìn)行表征和闡述。

7.4水分

適用時(shí)（如凍干樣品），需明確水分含量。除另有規(guī)定外，取供試品約1g～2g，按照《中華人民共和國藥典》“水分測(cè)定法”第二法（烘干法）測(cè)定，或取供試品約10mg按照《中華人民共和國藥典》“熱分析法”熱重法（TG）測(cè)定，升溫程序：從室溫以10℃/min速率升溫至105℃，保持60min。減失重量需符合所標(biāo)示范圍。規(guī)定仲裁方法為水分測(cè)定法。

7.5熾灼殘?jiān)?/p>

除另有規(guī)定外，取1.0-2.0g，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 熾灼殘?jiān)鼨z查法進(jìn)行檢測(cè)。

7.6酸堿度

液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則“pH值測(cè)定法”進(jìn)行檢測(cè)，需符合所標(biāo)示值的±1.0。

7.7滲透壓摩爾濃度

適用時(shí)，液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 滲透壓摩爾濃度測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)，滲透壓摩爾濃度范圍需符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

7.8動(dòng)力黏度（凝膠）

取供試品按照《中華人民共和國藥典》“黏度測(cè)定法”的“旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)定法”測(cè)定，需要詳細(xì)描述試驗(yàn)條件，動(dòng)力黏度值需符合所標(biāo)示范圍。

7.9裝量及差異

根據(jù)供試品性狀（溶液、凝膠、凍干海綿或凍干粉末等）和裝量的不同確定裝量的允差要求。例如：20g（mL）以下，單個(gè)裝量不低于標(biāo)示裝量的93%；20g（mL）至50g（mL），單個(gè)裝量不低于標(biāo)示裝量的95%；50g（mL）以上，單個(gè)裝量不低于標(biāo)示裝量的97%；平均裝量不低于標(biāo)示裝量。

8.降解特性及產(chǎn)物

需對(duì)膠原蛋白材料降解特性進(jìn)行研究，可采用凝膠滲透色譜（GPC）測(cè)定降解產(chǎn)物的分子量分布及分子量，水解/酶解產(chǎn)物可使用氨基酸分析儀、高效液相色譜或其他適宜的方法測(cè)定。

9.生物學(xué)功能評(píng)價(jià)

重組膠原蛋白的生物學(xué)功能是指以重組膠原蛋白生物學(xué)特性相關(guān)屬性為基礎(chǔ)的生物學(xué)作用，對(duì)聲稱的生物學(xué)功能宜進(jìn)行定性定量分析。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，重組人源化膠原蛋白作為重組膠原蛋白的一種，其主要生物學(xué)功能也同樣是為細(xì)胞提供支架和良好的微環(huán)境，如促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、生長、分化等。因此，可通過評(píng)價(jià)細(xì)胞-膠原蛋白相互作用來評(píng)價(jià)重組人源化膠原蛋白的生物學(xué)功能。細(xì)胞增殖、分化、黏附性、遷移或移行評(píng)價(jià)方法可參考YY/T 1849《重組膠原蛋白》。

由于膠原類材料在分子組成、微結(jié)構(gòu)、物理性能方面可能差異顯著，需檢測(cè)材料與細(xì)胞之間相互作用及其引導(dǎo)細(xì)胞基礎(chǔ)響應(yīng)的性能。細(xì)胞響應(yīng)的參數(shù)包括細(xì)胞形態(tài)、面積和體積，均可通過二維（2D）或三維（3D）圖像技術(shù)可視化評(píng)價(jià)，還包括存活率、增殖率、程序化凋亡以及遷移。

鼓勵(lì)對(duì)重組人源化膠原蛋白對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)理進(jìn)行研究。例如，抗體阻斷試驗(yàn)可用來確定細(xì)胞表面的何種受體參與了與膠原的作用，如整合素或盤狀結(jié)構(gòu)域受體（DDRs）。此外，細(xì)胞骨架成分（如肌動(dòng)蛋白）的協(xié)同作用也可用來評(píng)價(jià)細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附與收縮解離。有多種在單細(xì)胞或多細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)細(xì)胞引導(dǎo)的收縮解離的方法，包括自由漂浮組織構(gòu)建物的尺寸隨時(shí)間的變化、施加在培養(yǎng)-力學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)上力的大小，以及單個(gè)細(xì)胞在膠原網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)力和形變等。

其它適用于干細(xì)胞和祖細(xì)胞類型的細(xì)胞-膠原相互作用的功能性檢測(cè)包括細(xì)胞株的定向分化，特定干細(xì)胞或祖細(xì)胞的增殖，或組織形態(tài)發(fā)生（始于內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管形成）。按照《中華人民共和國藥典》 四部 進(jìn)行成纖維細(xì)胞生長因子生物學(xué)活性測(cè)定，對(duì)膠原蛋白肽-細(xì)胞相互作用評(píng)價(jià)，反映膠原蛋白肽與成纖維細(xì)胞增殖的構(gòu)效關(guān)系。

按照《中華人民共和國藥典》 四部 生物活性測(cè)定法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括對(duì)驗(yàn)證指標(biāo)結(jié)果的繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以及判斷其是否符合可接受標(biāo)準(zhǔn)等。常規(guī)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法一般要求數(shù)據(jù)之間相互獨(dú)立，并呈近似正態(tài)分布和方差齊性，通常采用相對(duì)效價(jià)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)無法滿足上述統(tǒng)計(jì)學(xué)要求時(shí)，也可考慮采用其他適宜的替代方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

上述關(guān)于膠原—細(xì)胞相互作用的功能性測(cè)定也可作為醫(yī)療器械產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的方法。三維支架材料中細(xì)胞活性評(píng)價(jià)方法可參考YY/T 1562《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 生物材料支架 細(xì)胞活性試驗(yàn)指南》。

（二）   材料免疫學(xué)安全性研究

臨床前安全性評(píng)價(jià)包括臨床前安全性試驗(yàn)，其目的主要是確定新膠原蛋白材料是否會(huì)在人體引起未能預(yù)料的不良反應(yīng)，免疫學(xué)安全性研究是重組人源化膠原蛋白材料生物安全性研究資料的主體。但是，用傳統(tǒng)生物試驗(yàn)方法來評(píng)價(jià)重組人源化膠原蛋白往往有困難，并受多種因素的影響。例如高度的種屬特異性，人的蛋白質(zhì)對(duì)人的生物學(xué)活性遠(yuǎn)高于對(duì)動(dòng)物的活性，而且人的蛋白質(zhì)氨基酸序列，常常與來自其它種系的蛋白質(zhì)不同，例如糖基。因而由基因工程技術(shù)所制備的蛋白質(zhì)或肽類往往會(huì)在人體以外的其它宿主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其生物學(xué)效應(yīng)有所改變，并可能因形成免疫復(fù)合物而導(dǎo)致有毒性反應(yīng)，而這樣產(chǎn)生的毒性反應(yīng)與人體安全性顯然無關(guān)。

另外，由于重組人源化膠原蛋白功能、生產(chǎn)工藝或者膠原蛋白材料穩(wěn)定性等要求，對(duì)膠原蛋白材料進(jìn)行修飾或者改構(gòu)，需提供與未修飾或者改構(gòu)材料比較的研究資料。以簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝為目的而引入的額外多肽片段如His-tag，在最終的材料成品中需符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1.免疫原及免疫化學(xué)檢驗(yàn)

基于部分人膠原蛋白核酸序列進(jìn)行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，特別是長期反復(fù)使用時(shí)，可能引起人體預(yù)測(cè)不到的免疫原性。因此，不能完全排除其免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，宜增加免疫學(xué)研究。重組人源化膠原蛋白作為醫(yī)療器械用原材料，可采用適宜方法進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)。若用動(dòng)物進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)，可能因?yàn)閯?dòng)物模型與臨床應(yīng)用之間存在種屬差異，帶來對(duì)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果或評(píng)價(jià)試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用上的局限，需要根據(jù)臨床評(píng)價(jià)獲得的免疫學(xué)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)及動(dòng)物模型獲得的免疫評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析。

患者對(duì)蛋白質(zhì)類材料產(chǎn)生免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)將隨醫(yī)療器械產(chǎn)品變化而變化。建議采用基于風(fēng)險(xiǎn)的方法來評(píng)價(jià)和減輕與影響人源化膠原蛋白安全性和有效性相關(guān)的免疫應(yīng)答。人源化膠原免疫原主要源自生產(chǎn)過程中殘留的可致免疫原性的各種因子，包括殘留的各種雜蛋白（包括DNA轉(zhuǎn)錄過程中可能產(chǎn)生的異種蛋白）、殘留的大腸桿菌及酵母菌外源性DNA、材料致熱原、生產(chǎn)過程中菌體產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素、DAMPs以及人源膠原特異性免疫等等。

為降低人源化膠原蛋白材料的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，一般需在材料設(shè)計(jì)及生產(chǎn)工藝中采取相應(yīng)處理措施以降低其免疫原性，如宿主細(xì)胞選擇，蛋白提取、蛋白純化。注冊(cè)申請(qǐng)人需對(duì)其降低材料免疫原性的有效性進(jìn)行驗(yàn)證，并提供驗(yàn)證試驗(yàn)性數(shù)據(jù)或相關(guān)研究資料。注冊(cè)申請(qǐng)人需提供免疫原性檢測(cè)范例的理論依據(jù)，需使用經(jīng)完全驗(yàn)證的檢測(cè)法對(duì)來自關(guān)鍵性研究的樣品進(jìn)行檢測(cè)，并提供支持該檢測(cè)法的全面驗(yàn)證的數(shù)據(jù)。

雜蛋白的檢測(cè)可參考YY/T 1453《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 I型膠原蛋白表征方法》，外源性DNA檢測(cè)可參考YY/T 0606.25《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第25部分 動(dòng)物源性生物材料DNA殘留量測(cè)定法：熒光染色法》。膠原蛋白材料的免疫原檢驗(yàn)可通過流式細(xì)胞術(shù)（FCM）或酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定，檢測(cè)試驗(yàn)宜考慮，但不限于淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（YY/T 0606.15《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第15部分 評(píng)價(jià)基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗(yàn)方法：淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)》）、細(xì)胞遷移試驗(yàn)（YY/T 0606.20《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第20部分：評(píng)價(jià)基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗(yàn)方法：細(xì)胞遷移試驗(yàn)》），采用非標(biāo)方法時(shí)需進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

免疫原性檢測(cè)可設(shè)計(jì)為檢測(cè)不期望的生物或生理結(jié)果的抗體，重組人源化膠原蛋白抗體可能降低效果或者引起過敏等反應(yīng)?？贵w檢測(cè)的免疫原試驗(yàn)可參考《中華人民共和國藥典》，選擇適宜的方法進(jìn)行，包括橋聯(lián)或均相酶免疫法、放射免疫沉淀試驗(yàn)等，并進(jìn)行相關(guān)的方法開發(fā)和試驗(yàn)驗(yàn)證。試驗(yàn)過程中，可根據(jù)滴度試驗(yàn)和中和活性試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)ADA進(jìn)行分析，還可進(jìn)行額外的抗體特征分析，包括抗體分型、抗原表位鑒定及交叉反應(yīng)評(píng)價(jià)。

篩選檢測(cè)法（也稱為結(jié)合抗體（BAb）檢測(cè)法）用于檢測(cè)與材料結(jié)合的所有抗體。使用確證性檢測(cè)法建立BAb對(duì)材料的特異性，使用滴定和中和檢測(cè)法進(jìn)一步表征重組人源化膠原蛋白抗體。使用滴定檢測(cè)法表征抗體應(yīng)答的量級(jí)，抗體對(duì)安全性和有效性的影響可能與其滴度和持續(xù)性而不是發(fā)生率相關(guān)。中和檢測(cè)法評(píng)估抗體干擾材料-靶標(biāo)相互作用的能力。中和抗體（NAb）是BAb的亞類，ADA對(duì)安全性和有效性的影響可能與NAb活性而不是抗體發(fā)生率相關(guān)。類似地，在一些情況下可能重要的是確定NAb滴度。用于檢測(cè)抗體的首選檢測(cè)法應(yīng)當(dāng)是檢測(cè)低親和力和高親和力抗體的高靈敏度篩選檢測(cè)法。注冊(cè)申請(qǐng)人在開發(fā)檢測(cè)方法以確認(rèn)重組人源化膠原蛋白特異性抗體結(jié)合時(shí)，需選擇合適的確證性檢測(cè)法以防止抗體假陽性數(shù)據(jù)，這些假陽性數(shù)據(jù)會(huì)混淆抗體對(duì)安全性和有效性影響的分析。

注冊(cè)申請(qǐng)人需提供支持該檢測(cè)法的全面驗(yàn)證的數(shù)據(jù)。驗(yàn)證包括證明用于給定樣品中抗體的定量測(cè)量的特定檢測(cè)法對(duì)于預(yù)期用途是可靠和可重現(xiàn)的?？贵w檢測(cè)法有助于評(píng)價(jià)材料的免疫原性，然而抗體的檢測(cè)依賴于檢測(cè)法的關(guān)鍵操作參數(shù)（如靈敏度、專屬性），一般來說，建議注冊(cè)申請(qǐng)人開發(fā)針對(duì)靈敏度、專屬性、選擇性、精確度、重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行優(yōu)化后的檢測(cè)法。

其他的免疫原評(píng)價(jià)及生物學(xué)性能及生物相容性評(píng)價(jià)等建議做醫(yī)療器械終產(chǎn)品的檢測(cè)，因?yàn)榧庸すに嚥煌罱K產(chǎn)品性能不同，例如有些交聯(lián)工藝可能會(huì)封閉某些免疫原反應(yīng)簇等等。

2.免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)

當(dāng)擬生產(chǎn)醫(yī)療器械免疫原性風(fēng)險(xiǎn)與已上市產(chǎn)品無可比性，且無充分的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)其免疫原性，需進(jìn)行免疫毒理學(xué)試驗(yàn)研究。通過免疫毒理學(xué)試驗(yàn)，對(duì)炎癥反應(yīng)、免疫抑制、免疫刺激、超敏反應(yīng)以及自身免疫進(jìn)行確證評(píng)價(jià)，評(píng)估免疫系統(tǒng)改變導(dǎo)致的潛在人體不良健康作用。

免疫毒理學(xué)可通過流式細(xì)胞術(shù)（FCM）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、組織病理切片等方法測(cè)定，試驗(yàn)方法可考慮結(jié)合生物學(xué)試驗(yàn)、體外T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（YY/T 1465.1《醫(yī)療器械免疫原性評(píng)價(jià)方法 第1部分 體外T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)》）等，注冊(cè)申請(qǐng)人需對(duì)選用檢測(cè)方法的適用性進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用非標(biāo)方法時(shí)需進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

可參考GB/T 16886.20《醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗(yàn)原則和方法》選擇性進(jìn)行功能性或非功能性免疫毒理學(xué)試驗(yàn)，通過嚙齒動(dòng)物試驗(yàn)方式檢測(cè)和評(píng)價(jià)物質(zhì)的不良作用。目前主要研究方法是將醫(yī)療器械/材料植入小鼠/模式小鼠，然后研究器械/材料整個(gè)降解周期內(nèi)機(jī)體的體液和細(xì)胞的免疫應(yīng)答，以及局部組織的免疫反應(yīng)。功能性檢測(cè)測(cè)定細(xì)胞和/或器官活性，例如淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原或特異性抗原的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性和特異性抗體的形成；非功能性檢測(cè)涵蓋形態(tài)學(xué)方面和/或定量的術(shù)語、淋巴組織變化程度、淋巴細(xì)胞數(shù)目和免疫球蛋白水平或其他免疫功能標(biāo)志物。

（三）   材料生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

作為制備醫(yī)療器械產(chǎn)品的原材料，需參照GB/T 16886.1的要求對(duì)重組人源化膠原蛋白原材料進(jìn)行必要的生物學(xué)評(píng)價(jià)，尤其通過膠原蛋白材料到醫(yī)療器械終產(chǎn)品的加工工藝分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)相近時(shí)。如預(yù)期用于植入產(chǎn)品的原材料，還需評(píng)估樣品是否為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活物。若醫(yī)療器械終產(chǎn)品與膠原蛋白材料的使用方法不一致，需考慮生物學(xué)補(bǔ)充研究。

根據(jù)GB/T 42062《醫(yī)療器械 風(fēng)險(xiǎn)管理對(duì)醫(yī)療器械的應(yīng)用》描述的風(fēng)險(xiǎn)管理過程進(jìn)行生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定，識(shí)別材料、添加劑、加工助劑和其他潛在可瀝濾物中的危害，接觸劑量等因素，繪制基于風(fēng)險(xiǎn)管理的生物學(xué)評(píng)價(jià)流程圖。

如果醫(yī)療器械產(chǎn)品以非滅菌的方式提供，可將樣品滅菌后用于生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)，需考慮滅菌方式及滅菌對(duì)重組人源化膠原蛋白的影響。

可能需要評(píng)價(jià)的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定終點(diǎn)包括但不限于：

1.細(xì)胞毒性

2.致敏性

注射膠原、膠原止血?jiǎng)┑染哂袧撛谏锟山到庑圆牧?，或體內(nèi)植入材料以及材料制備過程中新增了化學(xué)成分和制造加工助劑、裝配粘合劑/溶劑殘留物，以及成品中可能存在滅菌殘留物或滅菌過程所致的反應(yīng)性產(chǎn)物時(shí)，需進(jìn)行遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)。

3.皮膚刺激性

4.皮內(nèi)反應(yīng)

注射膠原、膠原止血?jiǎng)┑染哂袧撛谏锟山到庑圆牧匣蝮w內(nèi)植入材料以及材料制備過程中新增化學(xué)成分和制造加工助劑、裝配粘合劑/溶劑殘留物以及滅菌殘留物或滅菌過程所致的反應(yīng)性產(chǎn)物可能存在于成品時(shí)需進(jìn)行皮內(nèi)刺激試驗(yàn)。

5.材料介導(dǎo)的致熱性

6.全身毒性

7.溶血性

血管修復(fù)材料、創(chuàng)傷和燒傷修復(fù)材料、膠原止血?jiǎng)⑿呐K瓣膜等與循環(huán)血液接觸的外部接入材料和大部分植入材料以及全部植入血管系統(tǒng)材料需進(jìn)行溶血試驗(yàn)。

8.植入反應(yīng)

皮下植入（膠原支架、血管修復(fù)材料、創(chuàng)傷和燒傷修復(fù)材料、膠原止血?jiǎng)┑瓤山到?可吸收材料或需植入生物材料等需進(jìn)行皮下組織植入試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)）；肌肉植入；骨植入。

9.遺傳毒性。

（四）   穩(wěn)定性研究與直接接觸性容器/材料研究

1.穩(wěn)定性研究

重組人源化膠原蛋白生產(chǎn)過程中間體如涉及到貯存，則需開展相應(yīng)的穩(wěn)定性研究。采用擬貯存階段樣品的代表性批次開展研究，一般包括貯存、運(yùn)輸（如適用）和使用穩(wěn)定性研究等。研究開展前，需統(tǒng)籌制定穩(wěn)定性研究方案，關(guān)注各穩(wěn)定性研究所用樣品、直接接觸性容器/材料、檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)、檢測(cè)條件和分析檢項(xiàng)等。

研究中需對(duì)能夠反映質(zhì)量變化的敏感特征進(jìn)行研究，如含量、完整性、純度、微生物安全性和生物學(xué)特性等。需依據(jù)相應(yīng)的醫(yī)療器械產(chǎn)品的貯存運(yùn)輸條件開展研究，涵蓋設(shè)定的各項(xiàng)條件，如溫度、光照、反復(fù)凍融（冷凍貯存時(shí)）、振搖等方面。根據(jù)實(shí)際使用情況，開展使用中的穩(wěn)定性研究，例如復(fù)溶或解凍、與復(fù)溶稀釋劑的相容性研究等。研究中需采用與實(shí)際使用相同材質(zhì)的直接接觸性容器/材料。

2.直接接觸性容器/材料研究

如涉及貯存，需對(duì)直接接觸的包裝容器開展相應(yīng)的包材相容性研究。根據(jù)相容性研究結(jié)果，結(jié)合穩(wěn)定性研究，選擇合理的包裝容器。

另外，對(duì)制備工藝中與樣品接觸的容器和一次性使用材料（如貯存袋、過濾膜、層析介質(zhì)、管路等），需開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和/或相應(yīng)的相容性研究。

三、參考文獻(xiàn)

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附件：重組人源化膠原蛋白原材料制造過程控制

附件

重組人源化膠原蛋白原材料制造過程控制

制造過程控制主要涉及工程細(xì)胞構(gòu)建過程、生產(chǎn)用細(xì)胞的質(zhì)量控制及常規(guī)生產(chǎn)過程控制。本附件特別關(guān)注了較為復(fù)雜的動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)體系，細(xì)菌與酵母的生產(chǎn)過程控制需首先符合中國藥典第三部中《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制》的要求。植物與昆蟲體系制造重組人源化膠原蛋白，可參考本附件中適用的內(nèi)容并制定相應(yīng)的控制要素。

一、重組工程細(xì)胞構(gòu)建及生產(chǎn)用細(xì)胞的質(zhì)量控制

重組人源化膠原蛋白屬于采用重組DNA技術(shù)，對(duì)編碼所需人膠原蛋白的基因進(jìn)行遺傳修飾，利用質(zhì)粒等載體將目的基因?qū)脒m當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，表達(dá)并翻譯成蛋白質(zhì)，經(jīng)過提取和純化等步驟制備而成的重組膠原蛋白之一。

（一）工程細(xì)胞的構(gòu)建

1.宿主細(xì)胞的選擇、來源、歷史和一般特性

經(jīng)過全面檢測(cè)的種子細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)重組人源化膠原蛋白材料生產(chǎn)的前提和基礎(chǔ)。生產(chǎn)用種子細(xì)胞需具有共同的始祖細(xì)胞，保持相同的遺傳和生物學(xué)特征，在特定的培養(yǎng)環(huán)境和條件下持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)攜帶的外源目的基因。建議詳細(xì)闡述共同始祖細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)。只有經(jīng)過研究確定細(xì)胞在擴(kuò)增培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中的變化，才能夠有效控制風(fēng)險(xiǎn)性因素，滿足生產(chǎn)的持續(xù)需求，使膠原蛋白材料質(zhì)量保持一致。

本附件中的宿主細(xì)胞主要涵蓋來自于人或動(dòng)物的細(xì)胞系或者微生物細(xì)胞，動(dòng)物來源的細(xì)胞系可來自所有后生動(dòng)物，包括體外永生化的傳代細(xì)胞系以及有限傳代的二倍體細(xì)胞。微生物的來源包括細(xì)菌、真菌、酵母和其他單細(xì)胞生物。在宿主細(xì)胞選擇、重組工程細(xì)胞構(gòu)建以及生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增和監(jiān)控過程中，不僅要關(guān)注細(xì)胞的適用性、目的產(chǎn)物表達(dá)生產(chǎn)能力，同時(shí)還需重視伴隨細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的內(nèi)源性病毒、宿主細(xì)胞殘余蛋白和DNA、致腫瘤成分等潛在的風(fēng)險(xiǎn)性因素對(duì)重組人源化膠原蛋白材料帶來的安全性影響。在早期研究階段，需同步開展庫細(xì)胞、生產(chǎn)培養(yǎng)過程細(xì)胞、生產(chǎn)終末細(xì)胞的全面檢定和控制。針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，需進(jìn)行病毒和/或致瘤性成分的去除/滅活工藝的驗(yàn)證。

需選擇來源、背景十分清楚的適宜宿主細(xì)胞，明確存在的內(nèi)源性病毒和/或致瘤性等影響膠原蛋白材料安全性的因素，并結(jié)合膠原蛋白材料純化的程度、細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中風(fēng)險(xiǎn)性成分的去除/滅活能力及殘留量控制水平，以及臨床應(yīng)用適應(yīng)證和用法用量等特點(diǎn)綜合分析，經(jīng)利弊權(quán)衡后確定與特定膠原蛋白材料相適應(yīng)的宿主細(xì)胞。盡可能選擇致瘤性試驗(yàn)陰性和低增殖代次水平的宿主細(xì)胞。對(duì)于改良的傳代細(xì)胞、全新構(gòu)建的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，甚至腫瘤細(xì)胞等，由于前期研究、背景資料和致瘤性風(fēng)險(xiǎn)等積累的認(rèn)識(shí)有限，其開發(fā)應(yīng)用將引入新的安全性隱患，需要慎重權(quán)衡利弊，確保遺傳背景清晰，在開展充分研究的基礎(chǔ)上嚴(yán)格控制其潛在的風(fēng)險(xiǎn)性。

用于構(gòu)建重組工程細(xì)胞的宿主細(xì)胞其來源和培養(yǎng)歷史需足夠清楚，可溯源有關(guān)的背景資料。例如最初分離建立株/系的機(jī)構(gòu)，在不同機(jī)構(gòu)內(nèi)引進(jìn)和傳代經(jīng)過，既往進(jìn)行過的檢測(cè)分析項(xiàng)目和確證研究結(jié)果，細(xì)胞保存狀態(tài)，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)已達(dá)到的增殖代次/水平及傳代過程中所用過的人源或動(dòng)物源性材料等。需提供宿主細(xì)胞來源的相關(guān)資料和證明性文件，說明是否曾進(jìn)行過遺傳操作引入了外源基因序列，描述已進(jìn)行過的研究檢定項(xiàng)目例如細(xì)胞鑒定、內(nèi)源和外源性因子檢測(cè)等的結(jié)果及引進(jìn)時(shí)進(jìn)行的復(fù)核檢定結(jié)果。對(duì)于微生物細(xì)胞而言，需提供產(chǎn)生細(xì)胞系的物種、株和已知的遺傳和表型特征。如可能，還需提供其致病性、毒素產(chǎn)物和其他生物危害方面的資料。需說明所用細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞來源(實(shí)驗(yàn)室制備或來源于菌種庫)，引證科學(xué)文獻(xiàn)上的相關(guān)參考資料。直接從實(shí)驗(yàn)室獲得的資料是首選的，如果沒有這些資料，也可以利用文獻(xiàn)。

需闡述宿主細(xì)胞的基本特征，如形態(tài)、培養(yǎng)和生長一般特征、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液要求，新構(gòu)建的動(dòng)物細(xì)胞系需檢測(cè)致瘤性特征。對(duì)宿主系統(tǒng)（原核、真核、哺乳細(xì)胞等）的特性、遺傳背景、基因型、表型、抗性、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化條件特征都需有詳細(xì)的文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)資料?；咎卣餍畔⑴e例如表1。

2.宿主細(xì)胞鑒定

宿主細(xì)胞（原核、真核、哺乳細(xì)胞等）污染和營養(yǎng)缺陷表型(或基因敲除)、過表達(dá)及導(dǎo)入外源基因等鑒定檢測(cè)方法都需有詳細(xì)的文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)資料。舉例如表2。

3.重組工程細(xì)胞克隆構(gòu)建過程、篩選及相關(guān)鑒定

工程細(xì)胞的構(gòu)建一般包括基因獲得、質(zhì)粒構(gòu)建和表達(dá)體系構(gòu)建三個(gè)階段。舉例如圖1。

目前可采用多種表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、基因?qū)敕椒ê秃Y選標(biāo)記等進(jìn)行工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選，構(gòu)建成功的標(biāo)志是工程細(xì)胞能夠穩(wěn)定、高效地表達(dá)結(jié)構(gòu)正確且具有生物活性的目的產(chǎn)物，包括共表達(dá)的產(chǎn)物。因此，需盡可能提供關(guān)于重組工程細(xì)胞構(gòu)建和鑒定的詳細(xì)資料，重點(diǎn)描述的內(nèi)容舉例如表3。

3.1目的基因來源及插入目的基因的設(shè)計(jì)

需包括最初獲得目的基因序列的來源和背景方面的資料，包括但不限于用于制備目的基因cDNA的方法，以及必要的初步序列分析。

需根據(jù)人膠原蛋白的氨基酸序列和學(xué)術(shù)研究，檢索公開數(shù)據(jù)庫，如美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡(jiǎn)稱NCBI）生物信息數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、公開發(fā)表的蛋白質(zhì)學(xué)術(shù)論文等，獲取人膠原蛋白的氨基酸序列及其對(duì)應(yīng)的核酸序列，包括全長人氨基酸序列、片段人氨基酸序列、片段重復(fù)人氨基酸序列等。衡量目的基因質(zhì)量時(shí)至少需考量下述項(xiàng)目：

根據(jù)所選的核酸序列及質(zhì)粒進(jìn)行插入目的基因的設(shè)計(jì)，明確插入位點(diǎn)、標(biāo)簽序列或分泌表達(dá)信號(hào)肽。將目的插入序列翻譯成氨基酸序列，需提供該序列與人膠原蛋白氨基酸序列比對(duì)圖。帶有非膠原蛋白設(shè)計(jì)與修飾(標(biāo)簽、抗性等)，則需提供具體序列及修飾位點(diǎn)，最終產(chǎn)物的膠原蛋白序列與修飾需符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3.2載體選擇與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

需詳述表達(dá)載體構(gòu)建或改建的過程，對(duì)構(gòu)建成功的表達(dá)載體需進(jìn)行必要的鑒定，并提供相關(guān)試驗(yàn)資料如構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜等。根據(jù)設(shè)計(jì)的重組人源化膠原蛋白氨基酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的不同，選擇合適的質(zhì)粒以滿足目標(biāo)克隆的構(gòu)建，并提供質(zhì)粒的完整序列信息。舉例如下：

需提供有關(guān)表達(dá)載體詳細(xì)資料，包括基因的來源、克隆和鑒定，表達(dá)載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。需說明表達(dá)載體組成成分以及主要元件的來源和功能，包括插入基因和側(cè)翼區(qū)序列、復(fù)制子、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、抗性標(biāo)記以及主要的酶切位點(diǎn)等。提供至少包括構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜。

將目的基因序列插入質(zhì)粒中時(shí)，為保證重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，需提供重組質(zhì)粒至少含目的插入基因完整開放讀碼框的測(cè)序報(bào)告，并提供測(cè)序序列與設(shè)計(jì)序列的比對(duì)結(jié)果，二者需一致。需提供插入基因和表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。所有與表達(dá)有關(guān)的序列均需詳細(xì)敘述。主要質(zhì)量控制參數(shù)舉例：

需明確質(zhì)粒與菌種/細(xì)胞的儲(chǔ)存條件，例如質(zhì)粒溶液為-20℃，甘油菌為≤-60℃，等等。

3.3載體引入宿主細(xì)胞的方法及重組工程細(xì)胞的篩選

需詳細(xì)說明載體引入宿主細(xì)胞的方法和操作過程，重組工程細(xì)胞的篩選原理、條件和標(biāo)準(zhǔn)，以及采用何種方法增加基因拷貝數(shù)等。闡述外源基因引入宿主細(xì)胞后產(chǎn)生的變化，符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的候選細(xì)胞可能為多個(gè)細(xì)胞株，但擬用于建庫的細(xì)胞株需為經(jīng)研究比較后確定的單一細(xì)胞克隆。

3.3.1載體引入宿主細(xì)胞的方法

非病毒載體類基因修飾系統(tǒng)可通過物理、化學(xué)或生物轉(zhuǎn)導(dǎo)方式遞送進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入目的細(xì)胞后，通過轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯等方式發(fā)揮作用。

外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞有多種方法，宿主細(xì)胞類型不同，載體不同，導(dǎo)入方法也有差異。舉例如大腸桿菌屬于原核生物，常用的是熱擊轉(zhuǎn)化方法，將重組表達(dá)載體DNA分子轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞。酵母生長較迅速且細(xì)胞分散，常用的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法包括氯化鋰、電穿孔、基因槍和玻璃珠方法。這些方法常用于釀酒酵母，但也可用于其他真菌轉(zhuǎn)化，如酵母（例如粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和畢赤酵母）和絲狀真菌（例如曲霉屬菌種）。將外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體和胞核微注射法等，各種轉(zhuǎn)染方法的作用機(jī)制、轉(zhuǎn)染效率和優(yōu)缺點(diǎn)各不相同。

若采用基因編輯系統(tǒng)，建議對(duì)靶向序列、目的基因序列和基因編輯用酶等的序列和比例等進(jìn)行優(yōu)化。通過特定細(xì)胞中的基因編輯效果確認(rèn)基因編輯用酶和靶向序列的特異性，篩選最佳的靶向結(jié)合序列（如sgRNA序列），并采取措施降低基因脫靶、插入突變的概率及對(duì)目的細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的不良影響。對(duì)于轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，建議考慮整合位點(diǎn)的特異性和分布趨勢(shì)，以及轉(zhuǎn)座子在基因組中的移動(dòng)（genomicmobilization）等特征，進(jìn)行轉(zhuǎn)座子序列、轉(zhuǎn)座酶及相應(yīng)調(diào)控元件的優(yōu)化，合理設(shè)置轉(zhuǎn)座序列/轉(zhuǎn)座酶的比例、序列分布等。

3.3.2重組工程細(xì)胞的篩選

需檢測(cè)重組后細(xì)胞基本性狀的改變，比較研究插入外源基因后細(xì)胞致瘤性特征的改變。需說明表達(dá)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)（是否整合到染色體）并采用適宜的方法測(cè)定其拷貝數(shù)，需提供宿主和載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性資料。說明啟動(dòng)和控制目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)所采用的方法，并進(jìn)行初步的表達(dá)產(chǎn)物鑒別和表達(dá)水平檢測(cè)。

對(duì)于選定的工程細(xì)胞株需進(jìn)行充分的目的基因全序列確認(rèn)，以保證用于編碼和表達(dá)目的產(chǎn)物的基因在初始核酸序列上的正確性。需詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中，啟動(dòng)和控制克隆基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)所采用的方法及表達(dá)水平。

3.4合成表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建過程中關(guān)鍵質(zhì)量控制

此過程的質(zhì)量研究通常包括鑒別、結(jié)構(gòu)特征、理化特性、生物學(xué)活性、純度和雜質(zhì)分析等，建議采用多個(gè)代表性批次開展研究。

3.4.1鑒別和序列確認(rèn)

鑒別研究中，可采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，觀察是否存在特征性的帶型；也可以用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，分析片段大小是否與理論大小一致等方法。序列確認(rèn)研究中，建議開展全序列測(cè)定，重點(diǎn)關(guān)注目的基因和調(diào)控元件的序列正確性。

3.4.2結(jié)構(gòu)

建議采用適用的方法對(duì)結(jié)構(gòu)完整性和大小均一性進(jìn)行研究。如對(duì)于DNA，可關(guān)注其是否存在單鏈、雙鏈、線性/開環(huán)、環(huán)狀和超螺旋等多種結(jié)構(gòu)形式，以及可能的高級(jí)結(jié)構(gòu)等。

3.4.3理化特性

建議開展分子量、核酸濃度/含量、修飾位點(diǎn)及比例（如有）、物理特性（如pH、滲透壓）等方面的研究。

3.4.4生物學(xué)活性

根據(jù)作用機(jī)制，生物學(xué)活性研究通常包括對(duì)基因修飾效率、目的基因表達(dá)的水平、表達(dá)產(chǎn)物的功能或體外模擬生理功能的測(cè)定等。建議首選定量檢測(cè)方法，如可通過目的基因或基因編輯產(chǎn)物的表達(dá)量和功能進(jìn)行分析，關(guān)注表達(dá)產(chǎn)物是否與預(yù)計(jì)一致或蛋白表達(dá)/基因是否被抑制、空間結(jié)構(gòu)是否符合設(shè)計(jì)（如多聚體）等。當(dāng)采用體外轉(zhuǎn)染檢測(cè)細(xì)胞的方法時(shí)，需關(guān)注選擇的檢測(cè)細(xì)胞是否具有代表性和合理性。

3.4.5其他特性研究

對(duì)于使用基因編輯工具酶的修飾系統(tǒng)，質(zhì)量研究中建議持續(xù)關(guān)注對(duì)應(yīng)細(xì)胞中修飾系統(tǒng)的殘留情況，采用生物信息學(xué)工具分析靶細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)變化、單點(diǎn)和小規(guī)模基因突變以及外源DNA在基因組中的插入位置、拷貝數(shù)等，監(jiān)控基因編輯用酶的細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)時(shí)間，考察脫靶效應(yīng)及相應(yīng)的安全性影響等。對(duì)于制備過程中使用的酶類試劑，建議重點(diǎn)關(guān)注酶的功能活性，例如需關(guān)注所用DNA聚合酶的保真度和活性，消化酶的酶解作用、酶的非特異性消化條件等，同時(shí)需要關(guān)注酶的純度、生產(chǎn)過程中引入的雜質(zhì)等。對(duì)于核苷酸、5’-帽或帽類似物等原材料，其整體的質(zhì)量需符合制備的要求，建議關(guān)注鑒別、濃度、純度和雜質(zhì)等。制備過程建議避免使用氯化銫、溴化乙錠、氯仿等毒性物質(zhì)，避免使用動(dòng)物源胰蛋白胨、核酸酶等可能引入外源因子等風(fēng)險(xiǎn)的原材料。對(duì)于用作遞送系統(tǒng)的材料，其制備涉及的關(guān)鍵原材料（脂質(zhì)、陽離子聚合物等）需進(jìn)行充分的篩選和質(zhì)量控制。

（二）生產(chǎn)用細(xì)胞的質(zhì)量控制

連續(xù)傳代細(xì)胞生產(chǎn)重組人源化膠原蛋白材料的最大優(yōu)點(diǎn)是使每批膠原蛋白材料都有一個(gè)經(jīng)過檢定的共同起源細(xì)胞，因此建立細(xì)胞庫的目的就是為了保證生產(chǎn)的可持續(xù)性和膠原蛋白材料質(zhì)量的穩(wěn)定。重組人源化膠原蛋白材料的生產(chǎn)必須建立在有良好的細(xì)胞庫管理基礎(chǔ)上，載體細(xì)胞可以是細(xì)菌、酵母或其他真核細(xì)胞，已通過篩選、育種、復(fù)蘇等程序驗(yàn)證建立細(xì)胞庫而實(shí)現(xiàn)工程化，具有穩(wěn)定的遺傳表達(dá)和相應(yīng)的質(zhì)量控制體系。本部分以針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞庫的管理為例，進(jìn)行相關(guān)闡釋。

需建立細(xì)胞庫系統(tǒng)（細(xì)菌、酵母、哺乳細(xì)胞等其他）保存管理的相應(yīng)制度及文件，保證細(xì)胞庫符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，保障細(xì)胞庫的穩(wěn)定性，需對(duì)細(xì)胞庫進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，包括質(zhì)粒核酸序列、拷貝數(shù)、丟失率檢測(cè)；雜菌檢測(cè)（計(jì)數(shù)、菌落形態(tài)觀察、菌種鑒定）等；需提供細(xì)胞庫檢測(cè)報(bào)告。

1.細(xì)胞庫建立

細(xì)胞庫可為三級(jí)即原始細(xì)胞庫、主細(xì)胞庫（MCB）和工作細(xì)胞庫（WCB）；也可采用主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫組成的兩級(jí)細(xì)胞庫；在某些特殊情況下，也可使用主細(xì)胞庫一級(jí)庫。用于建庫的初始工程細(xì)胞株需為經(jīng)過克隆選擇而形成的均一細(xì)胞群體，必要時(shí)須經(jīng)與實(shí)際生產(chǎn)過程所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件相一致的適應(yīng)性培養(yǎng)。

2.建庫細(xì)胞的管理

在制備工作細(xì)胞庫過程中不得進(jìn)行單克隆篩選，以避免由于個(gè)別基因突變引起工作細(xì)胞庫中細(xì)胞群體性的遺傳特性改變；為了保證細(xì)胞庫中每個(gè)容器中的內(nèi)容物完全一致，如培養(yǎng)細(xì)胞采用幾個(gè)器皿的，需將所有培養(yǎng)皿中的細(xì)胞混合成單批后再分裝。

在細(xì)胞庫的建庫期間需采取適宜的預(yù)防措施，以確保細(xì)胞不被污染（包括微生物污染和實(shí)驗(yàn)室中其他類型細(xì)胞的交叉污染等）。各級(jí)種子庫的細(xì)胞需按照特定的要求經(jīng)過全面檢定合格后方可使用（具體要求參見本文細(xì)胞庫檢定）。

動(dòng)物細(xì)胞庫建庫的具體過程、方法和管理需符合中國藥典要求。

3.細(xì)胞庫檢定

正確的起始細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)良好生產(chǎn)的前提和基礎(chǔ)。檢定的目的是為了確認(rèn)經(jīng)過初步篩選建庫的細(xì)胞符合預(yù)期設(shè)計(jì)要求，攜帶有穩(wěn)定的目的基因，能夠持續(xù)表達(dá)有功能活性的目的產(chǎn)物，沒有微生物污染和混雜其它細(xì)胞，能夠直接擴(kuò)增儲(chǔ)備或者應(yīng)用于生產(chǎn)。

對(duì)于原始庫細(xì)胞和/或主庫細(xì)胞，通常需要進(jìn)行一次全面系統(tǒng)的研究檢定，包括遺傳學(xué)、生物學(xué)和微生物學(xué)，以便從源頭開始嚴(yán)格控制起始細(xì)胞的一致性和防止污染。經(jīng)過傳代穩(wěn)定性研究的主細(xì)胞到工作細(xì)胞，只經(jīng)過簡(jiǎn)單的傳代、擴(kuò)增，可以適當(dāng)簡(jiǎn)化檢定項(xiàng)目，重點(diǎn)檢測(cè)外源因子污染和防止混入了其它細(xì)胞。保存的數(shù)目和傳代水平需保證生產(chǎn)用細(xì)胞的持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)。

3.1細(xì)胞鑒定

要進(jìn)行目的蛋白表達(dá)穩(wěn)定性分析，即確證表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)序列與預(yù)期相符。

3.1.1細(xì)胞種屬的鑒定

需驗(yàn)明細(xì)胞的種屬來源，分析細(xì)胞的同一性，排除與其它細(xì)胞的交叉污染。鑒別試驗(yàn)可利用細(xì)胞的表型或遺傳型特征，通常對(duì)MCB作鑒別試驗(yàn)，而對(duì)每個(gè)WCB僅作有限的鑒別試驗(yàn)。

目前常用的方法有細(xì)胞生長特征和培養(yǎng)形態(tài)學(xué)檢查、種屬特異性抗原檢測(cè)、染色體核型分析、同工酶分析、限制性內(nèi)切酶分析、基因多態(tài)性分析等。需結(jié)合具體細(xì)胞固有的特性進(jìn)行適宜的組合和選擇，以實(shí)現(xiàn)正確鑒別為目的。

真核細(xì)胞用于生產(chǎn)時(shí)，細(xì)胞的鑒別標(biāo)志，如特異性同功酶或免疫學(xué)或遺傳學(xué)特征，對(duì)鑒別所建立的種子是有用的。有關(guān)所用傳代細(xì)胞的致癌性需有詳細(xì)報(bào)告。如采用微生物培養(yǎng)物為種子，則需敘述其特異表型特征。

3.1.2致瘤性試驗(yàn)

對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞，需檢測(cè)分析目的基因引入細(xì)胞后的致瘤性特征，對(duì)于陽性細(xì)胞，需研究確定致瘤性改變對(duì)膠原蛋白材料帶來的安全性風(fēng)險(xiǎn)。種子批不應(yīng)含有外源致癌因子。

3.1.3目的基因和表達(dá)框架分析

目的基因和表達(dá)框架的確證是種子庫細(xì)胞檢定的重要組成部分，對(duì)于表達(dá)正確的目的產(chǎn)物具有先決性意義。常用的方法包括：通過PCR擴(kuò)增樣本DNA來進(jìn)行DNA序列分析；通過限制性內(nèi)切酶譜和Southern雜交來檢測(cè)基因的完整性，確定目的基因的拷貝數(shù)，并檢測(cè)是否有任何序列插入或缺失等。

基因序列分析資料需包括試驗(yàn)方案和步驟、原始的測(cè)序圖、測(cè)得序列以及翻譯后的氨基酸序列，同時(shí)需將實(shí)際測(cè)得序列與理論序列進(jìn)行對(duì)比。清楚標(biāo)注兩者之間的異同。一般情況下，在原始種子階段需確證克隆基因的DNA序列。但在某些情況下，例如傳代細(xì)胞基因組中插入多拷貝基因。在此階段不適合對(duì)克隆基因作DNA序列分析。在此情況下，可采用總細(xì)胞DNA的雜交印染分析，或作mRNA的序列分析。對(duì)最終膠原蛋白材料的特征鑒定需特別注意。

為保證膠原蛋白材料結(jié)構(gòu)的正確和穩(wěn)定，基因序列分析需貫穿于重組工程細(xì)胞的篩選和鑒定、細(xì)胞庫的建立和檢定以及生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)控的全過程。

3.1.4表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)

需檢測(cè)分析目的產(chǎn)物的表達(dá)量和生物活性?；钚詼y(cè)定需選擇與其預(yù)期用途相對(duì)應(yīng)并能夠定量的方法?；钚詼y(cè)定方法學(xué)研究可貫穿于重組人源化膠原蛋白原材料研究的始終，并經(jīng)相關(guān)驗(yàn)證分析。

3.2微生物污染檢測(cè)

3.2.1細(xì)菌、真菌和支原體檢查

對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞庫，需對(duì)MCB、WCB和EPC（生產(chǎn)終末期細(xì)胞）進(jìn)行全面檢查，對(duì)生產(chǎn)培養(yǎng)過程中的細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在進(jìn)行支原體檢查時(shí)，需注意同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法兩種方法，或經(jīng)驗(yàn)證的qPCR法。必要時(shí)可采用掃描電鏡法檢查細(xì)胞是否受到特殊微生物的污染。在設(shè)計(jì)檢測(cè)微生物細(xì)胞庫中外源微生物因子和外源細(xì)胞污染的特異性試驗(yàn)方法時(shí)，需考慮以下問題：建庫細(xì)胞的性質(zhì)、科技文獻(xiàn)中報(bào)道的可能存在的污染、用于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞來源、方法和材料以及存在于建庫實(shí)驗(yàn)室中的其他生物等。

3.2.2病毒因子的檢查

包括細(xì)胞來源宿主動(dòng)物潛在的內(nèi)源性病毒和由于操作帶入的外源性病毒的檢查。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行病毒檢查的種類和方法，需根據(jù)細(xì)胞的種屬和組織來源、傳代歷史和細(xì)胞特性選擇。

3.2.1.1體外試驗(yàn)

需將MCB、WCB和EPC細(xì)胞活細(xì)胞或細(xì)胞裂解產(chǎn)物接種到盡可能多的病毒易感的指示細(xì)胞上。可以根據(jù)細(xì)胞來源，傳代史和細(xì)胞培養(yǎng)基的原料使用情況來選擇適宜的指示細(xì)胞。檢測(cè)結(jié)果需為陰性。

3.2.1.2體內(nèi)試驗(yàn)

通過接種乳鼠、成年小鼠、雞胚、豚鼠、家兔或其它敏感動(dòng)物來檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中潛伏性病毒。通常要對(duì)MCB、EPC進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。

3.2.1.3種屬特異性病毒的檢定

通過抗體產(chǎn)生試驗(yàn)來檢測(cè)可能存在于MCB細(xì)胞中的種屬特異性病毒，如嚙齒類動(dòng)物來源的細(xì)胞需進(jìn)行小鼠、倉鼠或大鼠的抗體生成試驗(yàn)。嚴(yán)格控制對(duì)于人類有危害的鼠源性病毒。

3.2.1.4逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)

逆轉(zhuǎn)錄病毒的試驗(yàn)需包括感染性試驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）檢測(cè)和電鏡技術(shù)檢查。需采用上述方法對(duì)MCB和EPC細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)。

3.2.1.4.1感染性試驗(yàn)

需根據(jù)細(xì)胞的特性及可能存在的逆轉(zhuǎn)錄病毒種類選擇適宜的檢測(cè)方法，如XC空斑試驗(yàn)（XC plaque）、延時(shí)XC空斑試驗(yàn)、S＋L－灶點(diǎn)分析（S＋L－Focus）等。試驗(yàn)時(shí)需注意設(shè)立恰當(dāng)?shù)年?陽性對(duì)照。

3.2.1.4.2逆轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)

為提高檢測(cè)的敏感性，通常需要將受試細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，收集上清液分別與檢測(cè)細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，再檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，注意設(shè)立恰當(dāng)?shù)年?陽性對(duì)照。

3.2.1.4.3透射電鏡檢查

透射電鏡下可觀察細(xì)胞基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特征以及逆轉(zhuǎn)錄病毒和病毒樣顆粒的存在，需比較未經(jīng)和經(jīng)過化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞。另外，需要對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液超速離心后所得的沉淀物經(jīng)負(fù)染后進(jìn)行檢查。觀察有無逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒以及顆粒的類型。

上述三種方法具有不同的檢測(cè)特性和靈敏度。因此，需采用不同的方法聯(lián)合檢測(cè)。若逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)陽性時(shí)，建議進(jìn)行透射電鏡檢查或感染性試驗(yàn)，如果確證對(duì)人或者其它靈長類動(dòng)物細(xì)胞有感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，該細(xì)胞不可用于生產(chǎn)。

4.細(xì)胞穩(wěn)定性研究

需包括庫細(xì)胞、生產(chǎn)過程中細(xì)胞、生產(chǎn)終末期和/或超過生產(chǎn)終末期等不同培養(yǎng)時(shí)期的細(xì)胞。庫細(xì)胞需重點(diǎn)考察貯存、復(fù)蘇等操作處理因素的影響和傳代過程中的遺傳穩(wěn)定性，在此基礎(chǔ)上確定庫細(xì)胞傳代限度，也需基于質(zhì)?？截悢?shù)及其在載體細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)限定生產(chǎn)過程中載體細(xì)胞的最高傳代次數(shù)，驗(yàn)證試驗(yàn)所涉及的傳代范圍需等于或超過規(guī)定的細(xì)胞最高限定代次。生產(chǎn)過程中細(xì)胞、生產(chǎn)終末期和/或超過生產(chǎn)終末期細(xì)胞需考察模擬生產(chǎn)工藝和培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞生長狀況、表達(dá)能力等的影響，并確定生產(chǎn)細(xì)胞增殖限度和/或連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間；使細(xì)胞始終能夠持續(xù)、穩(wěn)定地表達(dá)重組人源化膠原蛋白，并將對(duì)最終膠原蛋白原材料產(chǎn)生安全性影響的風(fēng)險(xiǎn)因素嚴(yán)格控制在最低限度。

4.1貯存條件下的穩(wěn)定性

當(dāng)儲(chǔ)存的細(xì)胞復(fù)蘇后用于生產(chǎn)膠原蛋白材料時(shí)，需進(jìn)行細(xì)胞存活率和功能活性等與細(xì)胞質(zhì)量密切關(guān)聯(lián)項(xiàng)目的研究測(cè)定，以證實(shí)復(fù)蘇細(xì)胞表達(dá)能力的穩(wěn)定性，需有對(duì)建庫細(xì)胞貯存條件下穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)的方案。這種監(jiān)測(cè)需在一支或多支冷凍保藏的WCB復(fù)蘇后制備生產(chǎn)用細(xì)胞時(shí)進(jìn)行，或當(dāng)一支或多支冷凍保藏的MCB復(fù)蘇并用于制備新WCB時(shí)進(jìn)行。如果長時(shí)間未進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)，需按上市申請(qǐng)時(shí)所述的間隔時(shí)間對(duì)生產(chǎn)用細(xì)胞庫進(jìn)行活力測(cè)試。如果細(xì)胞的活力沒有明顯的減退，一般不需對(duì)MCB或WCB作進(jìn)一步檢定。

4.2傳代/擴(kuò)增過程中的穩(wěn)定性

需對(duì)庫細(xì)胞和生產(chǎn)過程細(xì)胞進(jìn)行傳代/擴(kuò)增的穩(wěn)定性研究，可將復(fù)蘇的庫細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)至一定的代次和將工作庫細(xì)胞在模擬實(shí)際生產(chǎn)條件下連續(xù)培養(yǎng)、擴(kuò)增（逐級(jí)放大擴(kuò)增過程），直至預(yù)期培養(yǎng)時(shí)間以及超過預(yù)期時(shí)間之外的延長時(shí)間點(diǎn)，收獲后進(jìn)行檢測(cè)分析。通過考察目的基因、表達(dá)框架等在重組工程細(xì)胞中的傳代穩(wěn)定性和目的產(chǎn)物表達(dá)的穩(wěn)定性，制定庫細(xì)胞的限傳代次和生產(chǎn)細(xì)胞的增殖限度以保證實(shí)際生產(chǎn)過程中細(xì)胞整體擴(kuò)增水平以及伴隨的內(nèi)源性病毒和/或致瘤性風(fēng)險(xiǎn)等的抑制狀態(tài)在預(yù)期限度范圍內(nèi)。至少需包括以下方面的試驗(yàn)研究：

4.2.1基因水平的比較

目的基因編碼序列和表達(dá)框架不應(yīng)有錯(cuò)誤，包括突變、缺失、插入。并注意比較基因拷貝數(shù)的變化。

4.2.2目的產(chǎn)物表達(dá)水平的比較

目的產(chǎn)物的表達(dá)量和表達(dá)活性不應(yīng)有明顯降低，根據(jù)不同的重組人源化膠原蛋白和具體研究結(jié)果確定適宜的可接受標(biāo)準(zhǔn)。

4.2.3細(xì)胞自身的穩(wěn)定性

需重點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞在傳代/擴(kuò)增過程中的形態(tài)、生長、代謝等基本狀況，遺傳特征和致腫瘤特性的變化。

4.2.4內(nèi)源因子檢查

需動(dòng)態(tài)考察內(nèi)源因子的復(fù)制是否得到有效抑制。重點(diǎn)檢測(cè)由細(xì)胞來源動(dòng)物和宿主細(xì)胞特性所決定的易染病毒如內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，分析其對(duì)于人類的致病性和重要性，嚴(yán)格控制其產(chǎn)生的條件。

4.2.5致瘤性監(jiān)測(cè)

對(duì)于致瘤性試驗(yàn)陽性的細(xì)胞，尤其對(duì)動(dòng)物細(xì)胞，需通過比較研究考察細(xì)胞培養(yǎng)傳代過程中致瘤性特征的改變，例如試驗(yàn)陽性時(shí)的細(xì)胞代次、最低接種量、腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散、腫瘤增殖時(shí)間、瘤組織病理特征等。建議對(duì)不同劑量（低、中、高）進(jìn)行不同宿主細(xì)胞的致瘤性試驗(yàn)，直至篩選出低致瘤性細(xì)胞。

5.生產(chǎn)過程細(xì)胞質(zhì)量控制

種子庫細(xì)胞需在全面質(zhì)量研究和檢測(cè)分析基礎(chǔ)上，模擬實(shí)際生產(chǎn)過程進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并檢測(cè)分析目的基因表達(dá)的穩(wěn)定性、細(xì)胞生長狀況、污染控制、致腫瘤風(fēng)險(xiǎn)性等；規(guī)模化生產(chǎn)后須建立細(xì)胞生產(chǎn)培養(yǎng)過程的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)終末期需符合質(zhì)量控制相關(guān)要求。

對(duì)于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和/或致瘤性試驗(yàn)陽性的細(xì)胞，需依據(jù)工藝處理能力制定風(fēng)險(xiǎn)性成分的控制條件，并根據(jù)模擬生產(chǎn)狀態(tài)下取得的試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)制定廢棄收獲液的標(biāo)準(zhǔn)；生產(chǎn)工藝須包括有效的病毒和/或致瘤性成分的滅活/去除方法并經(jīng)過充分驗(yàn)證。

如果整個(gè)培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)例如培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間和/或限制代次、培養(yǎng)方式等發(fā)生重大改進(jìn)，細(xì)胞培養(yǎng)工藝進(jìn)行了放大，影響了原已確定的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，需重復(fù)進(jìn)行一次全面的檢測(cè)驗(yàn)證。

5.1常規(guī)生產(chǎn)過程監(jiān)控

經(jīng)研究確定了生產(chǎn)工藝條件之后，常規(guī)生產(chǎn)過程中可重點(diǎn)監(jiān)測(cè)微生物污染和細(xì)胞生長狀況，例如活細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)、代謝和功能狀態(tài)、目的蛋白表達(dá)狀況、潛伏性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組激活狀況、細(xì)菌和支原體污染以及其它要求等，在比較分析的基礎(chǔ)上確定批次或者連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)的終末細(xì)胞的檢測(cè)項(xiàng)目及可接受標(biāo)準(zhǔn)。

5.2細(xì)胞增殖限度

在細(xì)胞穩(wěn)定性試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，需結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)、維持等工藝過程中實(shí)際采用的生產(chǎn)方式如批式培養(yǎng)（batch culture）、流加培養(yǎng)(fed-batch culture)、灌注培養(yǎng)(perfusion culture)等各自特點(diǎn)，考察細(xì)胞體外連續(xù)擴(kuò)增、培養(yǎng)過程中發(fā)生的變化，例如細(xì)胞的生長狀態(tài)、內(nèi)源性病毒抑制狀態(tài)、目的蛋白表達(dá)的下降程度以及致瘤性改變等確定適宜的收獲方式、收獲時(shí)間、細(xì)胞終止培養(yǎng)時(shí)間和/或增殖代次，并預(yù)留充分的安全儲(chǔ)備。實(shí)際生產(chǎn)過程中細(xì)胞不得超過預(yù)先設(shè)定的培養(yǎng)時(shí)間和/或增殖限度

5.3其它風(fēng)險(xiǎn)性因素控制

培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞的質(zhì)量有直接的影響，也是細(xì)胞污染的可能來源之一。需明確培養(yǎng)基的組成、來源及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于動(dòng)物源性添加成分，需盡可能控制并減少其使用；如確需使用，需闡明選擇的理由，并說明該成分的來源和病毒安全性控制方法。目前提倡采用無血清培養(yǎng)基，并盡可能減少用于處理細(xì)胞（例如從貼壁狀態(tài)中游離或者分散）的動(dòng)物來源的蛋白酶。各種培養(yǎng)基的來源和質(zhì)量檢測(cè)數(shù)據(jù)均需有可追溯的文件記錄。如培養(yǎng)中使用了牛源性物質(zhì)，需明確其來自非BSE疫區(qū)，并需按照國家食品藥品監(jiān)督管理局的相關(guān)規(guī)定提供必要的證明性文件。

細(xì)胞培養(yǎng)條件的研究中，需考察使內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制和癌基因相關(guān)序列激活或者復(fù)制受抑制的控制條件，對(duì)模擬生產(chǎn)條件下的狀況進(jìn)行分析，確定可實(shí)際控制的程度。生產(chǎn)中需嚴(yán)格執(zhí)行研究確定的控制條件。

6.風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與控制

細(xì)胞系/庫的建立，其序列的設(shè)計(jì)、生產(chǎn)用材料、制備工藝、質(zhì)量、穩(wěn)定性、內(nèi)包材的要求可依具體情況，結(jié)合細(xì)胞系/庫的質(zhì)量研究結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估?？山Y(jié)合生產(chǎn)使用情況和細(xì)胞系/庫的研究和檢測(cè)情況，制定重組人源化膠原蛋白原材料的風(fēng)險(xiǎn)控制策略。良好的重組人源化膠原蛋白原材料質(zhì)量研究與控制有利于篩選、建立出質(zhì)量良好的細(xì)胞系/庫，有利于后續(xù)的生產(chǎn)研究。在細(xì)胞系/庫建立過程中，建議對(duì)細(xì)胞系/庫進(jìn)行檢定和傳代穩(wěn)定性研究，關(guān)注細(xì)胞系/庫功能是否符合理論設(shè)計(jì)和預(yù)期、安全是否可控，必要時(shí)對(duì)工程細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量研究，以確認(rèn)其適用性。

隨著技術(shù)不斷更新和研究經(jīng)驗(yàn)的逐步積累，研發(fā)過程常常伴隨重組人源膠原合成表達(dá)系統(tǒng)的升級(jí)和工藝的優(yōu)化，因此研發(fā)各階段有可能發(fā)生變更。系統(tǒng)的變更可能顯著影響工程細(xì)胞的安全性和有效性，是重要風(fēng)險(xiǎn)之一，研發(fā)者需評(píng)估變更引入的影響和風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估情況，對(duì)重組人源膠原合成表達(dá)系統(tǒng)及其工程細(xì)胞的質(zhì)量、工藝控制、穩(wěn)定性等方面進(jìn)行深入研究，合理設(shè)計(jì)變更可比性研究方案。

二、常規(guī)生產(chǎn)過程控制

重組人源化膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特性容易受到各種理化因素的影響，且分離提純工藝復(fù)雜，因此其質(zhì)量控制體系是針對(duì)生產(chǎn)全過程，采用化學(xué)、物理和生物學(xué)等手段而進(jìn)行的全程、實(shí)時(shí)的質(zhì)量控制。生產(chǎn)過程中每一環(huán)節(jié)或制備條件的改變均可能影響其非臨床安全性評(píng)價(jià)的合理性。

（一）載體制備工藝

不同目的基因和表達(dá)載體的載體制備工藝可能有差異。以質(zhì)粒DNA為例，其制備步驟一般包括微生物培養(yǎng)及發(fā)酵、菌體收集、菌體裂解、質(zhì)粒純化、濃縮、灌裝等。工藝研究與確定過程需對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行探索和優(yōu)化，建立穩(wěn)定的制備工藝。關(guān)鍵工藝參數(shù)可能包括發(fā)酵培養(yǎng)基組成、發(fā)酵培養(yǎng)溫度、補(bǔ)料培養(yǎng)基組成、補(bǔ)料時(shí)間和補(bǔ)料量、溶氧量、堿裂解緩沖液及中和緩沖液的組成、堿裂解時(shí)間、層析柱載量、層析流速等。研究中建議關(guān)注制備全過程對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和功能的可能影響，如堿裂解步驟可能產(chǎn)生的質(zhì)粒不可逆變性的情況等。純化工藝開發(fā)過程中，可以根據(jù)質(zhì)粒的實(shí)際大小和性質(zhì)選擇合適的柱層析填料，最大程度去除宿主RNA、宿主DNA、DNA碎片和細(xì)菌內(nèi)毒素等雜質(zhì)。根據(jù)研究，設(shè)置合理的過程控制指標(biāo)和可接受標(biāo)準(zhǔn)，如質(zhì)粒中間產(chǎn)物的濃度、超螺旋比例、雜質(zhì)殘留量等。

（二）發(fā)酵

需對(duì)生產(chǎn)過程中使用的各種原材料進(jìn)行質(zhì)量控制，以保證這些原材料符合既定用途的要求。需根據(jù)生產(chǎn)過程中培養(yǎng)、增殖和蛋白表達(dá)量一致性的研究資料，確定轉(zhuǎn)罐、誘導(dǎo)、終止培養(yǎng)的技術(shù)參數(shù)。需根據(jù)生產(chǎn)工藝驗(yàn)證資料，明確生產(chǎn)過程中的工藝參數(shù)，如培養(yǎng)基滅菌時(shí)間滅菌溫度、培養(yǎng)周期等；同時(shí)根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)差異，針對(duì)性的建立細(xì)胞（細(xì)菌、酵母或其他）生長的主要質(zhì)控指標(biāo)（包括但不限于發(fā)酵液OD值、pH值、目標(biāo)蛋白分子量、蛋白表達(dá)量、質(zhì)粒穩(wěn)定性等）。

1.有限代次生產(chǎn)

對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞等隨著傳代次數(shù)增加可能喪失穩(wěn)定表達(dá)的宿主細(xì)胞，需予以有限代次生產(chǎn)；對(duì)于大腸桿菌、畢赤酵母等表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的宿主細(xì)胞，必要時(shí)進(jìn)行代次穩(wěn)定性驗(yàn)證后，可不限定代次生產(chǎn)。用于培養(yǎng)和誘導(dǎo)基因產(chǎn)物的材料和方法需有詳細(xì)的資料。培養(yǎng)過程及收獲時(shí)，需有敏感的檢測(cè)措施控制微生物污染。

需提供培養(yǎng)生長濃度和產(chǎn)量恒定性方面的數(shù)據(jù)，并需確立廢棄一批培養(yǎng)物的指標(biāo)。根據(jù)宿主細(xì)胞／載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性資料，確定在生產(chǎn)過程中允許的最高細(xì)胞倍增數(shù)或傳代代次，并需提供最適培養(yǎng)條件的詳細(xì)資料。

在生產(chǎn)周期結(jié)束時(shí)，必要時(shí)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)的特性，例如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度、含插入基因的載體的酶切圖譜。一般情況下，用來自一個(gè)原始細(xì)胞庫的全量培養(yǎng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，宜適時(shí)做一次目的基因的核苷酸序列分析。

2.連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)

基本要求同“1.有限代次生產(chǎn)”。

必要時(shí)監(jiān)測(cè)經(jīng)長期培養(yǎng)后所表達(dá)基因的分子完整性，以及宿主細(xì)胞的表型和基因型特征。每批培養(yǎng)的產(chǎn)量變化需在規(guī)定范圍內(nèi)。對(duì)可以進(jìn)行后處理及應(yīng)廢棄的培養(yǎng)物，需確定指標(biāo)。從培養(yǎng)開始至收獲，需有敏感的檢查微生物污染的措施。

根據(jù)宿主/載體穩(wěn)定性及表達(dá)產(chǎn)物的恒定性資料，需規(guī)定連續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間。如屬長時(shí)間連續(xù)培養(yǎng)，需根據(jù)宿主/載體穩(wěn)定性及產(chǎn)物特性的資料，在不同間隔時(shí)間作全面檢定。

（三）純化

根據(jù)生產(chǎn)工藝需求，可以將純化過程分為粗純、精純、換液、濃縮等工序，關(guān)于純度的要求可視膠原蛋白材料的用途和用法而確定。例如，僅使用一次或需反復(fù)多次使用時(shí)，用于健康人群或用于重癥患者時(shí)，都可對(duì)純度有不同程度要求。不同載體細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可能對(duì)純化過程的要求有所不同，但所采用的分離、純化、濃縮方法或技術(shù)，需能適用于規(guī)?；a(chǎn)并保持穩(wěn)定。

生產(chǎn)中可能引入一些特定的工藝雜質(zhì)，純化工藝需保證能將其去除或降低至可接受的水平。雜質(zhì)主要包括與工藝相關(guān)的雜質(zhì)和膠原蛋白材料相關(guān)雜質(zhì)以及環(huán)境污染雜質(zhì)。工藝相關(guān)的雜質(zhì)是指生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞蛋白、DNA，培養(yǎng)物（誘導(dǎo)劑、抗生素或其他培養(yǎng)基成分等），純化等工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)（酶、化學(xué)試劑、無機(jī)鹽、溶劑、載體、抗體等）；膠原蛋白材料相關(guān)雜質(zhì)是指膠原蛋白材料異質(zhì)性，如肽鏈的截短或延長形式、修飾形式（去酰胺化、異構(gòu)體、二硫鍵錯(cuò)配、糖基化、磷酸化等）、聚合體、多聚體等；環(huán)境污染雜質(zhì)包括細(xì)菌內(nèi)毒素、可能攜帶的病毒和有害微生物等，宿主細(xì)胞（如細(xì)菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞）的污染也存在潛在的危險(xiǎn)性。具體內(nèi)容詳見本指導(dǎo)原則“二（一）5.雜質(zhì)、污染物和添加劑”的內(nèi)容。

對(duì)于生產(chǎn)過程中的收獲、分離和純化方法需詳細(xì)記述，需特別注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物質(zhì)的去除，如采用親和層析技術(shù)，例如用單克隆抗體，需有檢測(cè)可能污染此類外源性物質(zhì)的方法，不應(yīng)含有可測(cè)出的異種免疫球蛋白。需驗(yàn)證這些分離、純化關(guān)鍵工序及雜質(zhì)檢測(cè)方法。對(duì)整個(gè)純化工藝需進(jìn)行全面研究，包括對(duì)宿主細(xì)胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過程中加入的有害的化學(xué)物質(zhì)等的去除?？梢圆捎眠^濾、離心等操作進(jìn)行分離，通過洗濾參數(shù)、相對(duì)離心力等工藝參數(shù)進(jìn)行必要的控制；可以采用蛋白層析或者離子交換層析等技術(shù)進(jìn)行純化。

可使用層析的方法提高膠原蛋白材料的純度，但需充分考慮到層析參數(shù)的選擇和層析樹脂的質(zhì)量對(duì)膠原蛋白材料質(zhì)量的影響，需要重點(diǎn)關(guān)注工藝對(duì)病毒的滅活與去除能力。病毒滅活/去除驗(yàn)證需符合《中華人民共和國藥典》通則“生物制品病毒安全性控制”等技術(shù)文件的要求。所采用的分離、純化工藝需能確保較好地保留膠原蛋白材料的理化和生物學(xué)性質(zhì)，保留目標(biāo)肽段的生物學(xué)活性。

采用乙醇等沉淀法時(shí)，需對(duì)乙醇等試劑的質(zhì)量進(jìn)行控制，并對(duì)膠原濃度、溫度、pH值、離子強(qiáng)度、處理時(shí)間等進(jìn)行研究，明確可接受的限度范圍。采用層析方法時(shí)，需根據(jù)產(chǎn)物中膠原的性質(zhì)和濃度，優(yōu)化色譜條件、確定合理的參數(shù)，如層析柱的容量、料液及緩沖液的離子強(qiáng)度和緩沖液的 pH值、流速、接觸時(shí)間和溫度等，這些參數(shù)的確定需以工藝開發(fā)的研究數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，均需制定限度標(biāo)準(zhǔn)和容許范圍。同時(shí)，還需對(duì)層析樹脂的清潔、再生（使用壽命）、層析柱的載量、浸出物等進(jìn)行研究，尤其是使用具有潛在有害配體的層析填料。需關(guān)注每一步分離純化步驟的體積、膠原濃度、回收率、電泳純度等，評(píng)估對(duì)工藝相關(guān)雜質(zhì)和膠原蛋白材料相關(guān)雜質(zhì)的去除能力。必要時(shí)，為了證明該工藝對(duì)雜質(zhì)的清除能力，可能需要采用加標(biāo)試驗(yàn)評(píng)估工藝對(duì)某些潛在污染物的清除能力。如涉及中間產(chǎn)物的暫存、運(yùn)輸?shù)瓤赡苡绊懏a(chǎn)品質(zhì)量的操作時(shí)，需有必要的穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)支持。

鼓勵(lì)采用創(chuàng)新和改進(jìn)工藝（包括對(duì)乙醇分離工藝的改進(jìn)），提高膠原利用率和質(zhì)量。在前期工藝開發(fā)過程中，需注意關(guān)鍵工藝參數(shù)的識(shí)別，關(guān)注不同分離階段工藝控制的完整性、工藝參數(shù)設(shè)置的合理性。如注冊(cè)申請(qǐng)人已有相同分離純化工藝的膠原蛋白材料上市，已有工藝研究數(shù)據(jù)、控制參數(shù)等可供借鑒時(shí)，需開展新膠原的3批生產(chǎn)規(guī)模工藝驗(yàn)證。

換液可將蛋白溶劑置換至工藝要求的工作液中，濃縮將蛋白濃縮至工藝要求的濃度。質(zhì)控點(diǎn)通常包括膜截留效率、蛋白含量、電導(dǎo)率等。

需建立重組人源化膠原蛋白原材料成品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的試驗(yàn)方法，詳見正文“二、（一）重組人源化膠原蛋白原材料性能研究”。對(duì)生產(chǎn)過程中的原液、半成品及生產(chǎn)原輔料，需注意如下方面。

1.原液要求

經(jīng)純化、換液、濃縮后即為重組人源化膠原原液。如需加入穩(wěn)定劑或賦形劑，需不影響質(zhì)量檢定，否則需在添加輔料前取樣進(jìn)行原液檢定。原液的檢測(cè)項(xiàng)目取決于工藝的驗(yàn)證、一致性確認(rèn)、預(yù)期膠原蛋白材料相關(guān)雜質(zhì)與工藝相關(guān)雜質(zhì)的水平、預(yù)期用途等，需采用適當(dāng)方法對(duì)原液質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)需與參比品進(jìn)行比較。原液的儲(chǔ)存需通過穩(wěn)定性驗(yàn)證確定儲(chǔ)存條件和時(shí)間。參比品的建立和制備需參照《中華人民共和國藥典》“生物制品國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備和標(biāo)定”的相關(guān)要求或YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的相關(guān)要求。

原液的檢測(cè)項(xiàng)目可包括蛋白表征研究（如肽段覆蓋率、C端序列、N端序列、氨基酸組成、異質(zhì)組成、X-射線衍射分析（XRD）、掃描電鏡分析、晶體結(jié)構(gòu)學(xué)研究、紅外光譜、圓二色譜、差示掃描量熱分析、等電點(diǎn)、肽圖等指標(biāo)）；理化性能指標(biāo)檢測(cè)（如鑒別、pH、蛋白含量、純度、分子量等指標(biāo)）；污染物殘留指標(biāo)檢測(cè)（如外源性DNA殘留、宿主細(xì)胞蛋白殘留、糖類殘留、抗生素殘留、誘導(dǎo)劑殘留、重金屬總量及微量元素殘留等指標(biāo)）；生物性能指標(biāo)檢測(cè)（如微生物限度/無菌、內(nèi)毒素殘留、熱原等指標(biāo)）?；谀z原蛋白材料應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，提供研究性資料或驗(yàn)證報(bào)告。

2.半成品要求

可由一批或多批原液合并生產(chǎn)半成品。擬混合的每批原液應(yīng)在有效期內(nèi)，需按規(guī)定的工藝生產(chǎn)、單獨(dú)檢驗(yàn)，并符合相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；混合的各批原液需可有效追溯；需對(duì)混合工藝進(jìn)行驗(yàn)證。

如需對(duì)半成品進(jìn)行稀釋或加入其他輔料，如防腐劑或賦型劑甘油、甘露醇及緩沖鹽等，需確定半成品的質(zhì)量控制要求，包括檢定項(xiàng)目和可接受標(biāo)準(zhǔn)。檢定項(xiàng)目可包括蛋白含量、pH等指標(biāo)。

3.生產(chǎn)原輔料要求

原輔料需按照國家藥品監(jiān)督管理局有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。動(dòng)物源性原料的使用需提供來源及質(zhì)控檢測(cè)資料；發(fā)酵用培養(yǎng)基若添加β內(nèi)酰胺類抗生素，最終材料成品中不得檢出。